UPLC-MS/MS测定小麦茎秆木质素单体交联结构的方法

孙淑芳 骆永丽 李春辉 金敏 胥倩

（山东农业大学农学院 作物生物学国家重点实验室，泰安 271018）

木质素作为一种十分重要的可再生资源，受到越来越多的人关注［1-4］。但由于木质素的结构非常复杂，利用率极低。木质素是一种复杂的芳香族聚合物，由对香豆醇（p-coumaryl alcohol，H）、芥子醇（sinapyl alcoho，S）、松柏醇（coniferyl alcohol，G）3种单体通过不同的连接方式聚合而成［5-6］。木质素单体连接键包括 8-O-4、8-5、8-8、5-5、5-O-4、7-O-4等连接方式［7-10］。其中，8-O-4是最常见的，该键比其他键更容易断裂［11］。另外，单体的比例不同，连接键的比例和种类不同。比如，富含G单体的木质素含有丰富的8-5、5-5、5-O-4键；富含S单元的木质素交联度较低，提取的难度较小［12］。因此，确定小麦茎秆中木质素单体的交联结构特性对木质素的开发利用尤为重要。

木质素的表征是木质素开发利用的关键。目前，主要采用溴乙酰法、Klason法、巯基乙酸法（thioglycollic acid，TGA）、酸性洗涤法测定木质素的含量，这些方法通过降解细胞壁和木质素，测定可溶性降解产物，从而获取细胞壁中不溶性木质素的含量，但这些方法无法获取关于木质素单体的相关信息［13-16］。碱性硝基苯氧化法是通过在样品中加入硝基苯，经高温条件反应后获取木质素单体含量的方法，但是该方法无法提供木质素结构特性的相关信息［17］。紫外光谱（ultraviolet absorption spectrometry，UV）、紫外-可见-近红外吸收光谱（UV-visible-NIR absorption spectra，UV-Vis-NIR）、红外光谱（infrared spectroscopy，IR）是利用木质素官能团在不同位置的特征吸收峰对木质素进行定性分析，但不能提供木质素单体序列和交联结构的精确信息［18-22］。

本研究通过使用不同比例的3种单体和过氧化物酶模拟木质素单体的自然聚合过程，在体外聚合形成木质素二聚体、三聚体等结构。同时，将小麦茎秆中的可溶性木质素温和提取而不降解，利用超高效液相色谱-质谱联用（UPLC-MS/MS）分析其结构和含量。定性和定量分析小麦茎秆内可溶性木质素低聚体，更精确地测定小麦茎秆木质素单体交联结构组成和含量，为木质素的开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

选用山农16的茎秆作为试验材料。取拔节后14 d的小麦茎秆（用剪刀将茎秆最上部和最下部的茎节剪掉，留茎秆中部），液氮速冻后，-80℃保存。

1.2 方法

1.2.1 标准溶液配制 将3种单体（对香豆醇（H）、松柏醇（G）和芥子醇（S））混合（每种单体称取3 mg）溶于2 mL含27 mmol/L的（CTA）2SO4磷酸钠缓冲液（10 mmol/mL，pH 6.5）。加入 67 μL 3% H2O2和0.3 mg II型辣根过氧化物酶。30℃水浴1 h，用1 mL 5%的Na2S2O7水溶液中止反应。用0.6 mL乙酸乙酯萃取木质素单体和低聚物，再用饱和NaCl水溶液洗涤、涡旋振荡2 min，4 727 r/min离心5 min，吸取上层清液，在真空浓缩仪中蒸干。最后，将干燥的样品溶解在2 mL含有35%乙腈的水溶液中，等待上机。

1.2.2 样品制备 样品处理：称取冻干的样品粉末0.5 g，加入2 mL萃取剂（乙醇∶超纯水=80∶20，V/V），振荡混匀2 min。然后常温条件超声30 min。4℃4 727 r/min离心5 min，取上清。样品残渣中再次加入2 mL乙醇，重复上面的步骤，获取上清液，将上清液放在真空离心浓缩仪中蒸干，然后加入2 mL乙酸乙酯溶解萃取木质素，涡旋振荡2 min。4 727 r/min离心5 min，取上清，将上清液再次放入真空离心浓缩仪中蒸干，然后加入2 mL乙腈水溶液（乙腈∶超纯水=35∶65，V/V）溶解，过0.22 μm有机系滤器，备用。

1.2.3 超高效液相-三重四级杆质谱条件 流动相A：超纯水，流动相B：乙腈，梯度洗脱（0-0.5 min，95% A，0.5-3 min，95% A-75% A线性降低，3.0-3.5 min，75% A-10% A线性降低，3.0-4.0 min，10% A，4.0-4.1 min，10% A-95% A线性提高，4.1-6.0 min，95% A，表1）。色谱柱为 ACQUITY UPLC®BEH C18，1.7 μm，2.1 mm×100 mm，柱温为 40℃。

表1 液相方法表Table 1 Liquid phase method

质谱条件为：MS系统：ACQUITY XEVO TQ-D，电离模式：电喷雾离子源负离子模式（ESI-）；源温度：150℃，脱溶剂气温度：450℃；脱溶剂气流速：800 L/h，锥孔气流速：30 L/h，碰撞气流速：0.20 mL/min，毛细管电压：负离子为2.5 kV；脱溶剂气温度：450℃；扫描模式：多反应监测MRM；雾化气：氮气。各木质素单体交联结构的质谱参数见表2。

表2 各木质素单体交联结构的质谱参数表Table 2 Mass spectrum parameters of crosslinking structures of lignin monomers

2 结果

2.1 定性与定量

图1分别为UPLC分析标准品S（8-O-4）S（8-8）S、S（8-O-4）G（8-O-4）S、G（8-O-4）S（8-5）G、S（8-O-4）S（8-5）G、G（8-O-4）S（8-8）S、G（8-O-4）G（8-5）G、S（8-O-4）S、G（8-5）H、G（8-8）G的色谱图。9种交联结构的保留时间分别为 4.08、4.00、4.04、4.04、4.08、4.02、4.01、4.05和4.03 min。图2为实际样品中9种木质素单体交联结构的保留时间，分别为4.08、3.99、4.04、4.04、4.08、4.02、4.01、4.05和4.03 min。可以确定样品中检测的木质素单体交联结构分别为S（8-O-4）S（8-8）S、S（8-O-4）G（8-O-4）S、G（8-O-4）S（8-5）G、S（8-O-4）S（8-5）G、G（8-O-4）S（8-8）S、G（8-O-4）G（8-5）G、S（8-O-4）S、G（8-5）H和G（8-8）G。由于无9种交联结构的商品化标准品，本试验以50 μg/L芥子醛为基准，对样品中木质素单体交联结构进行定量（表3）。

表3 拔节后14 d小麦茎秆中9种木质素单体交联结构的含量Table 3 Contents of crosslinking structures of 9 lignin monomers in wheat stems at 14 d after jointing

图1 UPLC分析标准品中不同交联结构的色谱图Fig.1 Chromatogram of different crosslinking structures in UPLC analytical standards

图2 UPLC分析样品中不同交联结构的色谱图Fig.2 Chromatogram of different crosslinking structures in UPLC analysis samples

2.2 方法学验证

2.2.1 标准曲线的建立 由于无商品标准品，本发明制备的标准品为混合物，故以芥子醛为基准，对木质素单体交联结构进行定量。配制0.05-100 ng/L的标准溶液，以峰面积（y）对芥子醛浓度（x，μg/L）作图，回归方程为：y=23.914 5x+131.997，相关系数（R2）=0.998 9。

2.2.2 样品精密度 同一试验样品重复进样（n=6），9种木质素单体交联结构含量的平均值分别为0.03、0.04、0.55、0.05、0.29、0.03、0.05、9.79 和 0.15 ng/g。9种木质素单体交联结构的RSD分别为2.10%、1.80%、0.57%、1.55%、0.87%、2.10%、1.93%、0.24%和1.28%（表4）。因此，该方法对9种木质素单体交联结构的分析具有良好的精密度和重复性。

表4 拔节后14 d小麦茎秆中9种木质素单体交联结构含量的精度分析Table 4 Accuracy analysis of crosslinking structure contents of 9 lignin monomers in wheat stems at 14 d after jointing

2.2.3 加样回收率试验 测定样品木质素单体交联结构的含量，添加不同水平的标准品，测定样品加标后每种木质素单体交联结构的含量，计算回收率（表5）。回收率为91.67%-100%。

3 讨论

木质素的高值、高效利用，对于人类的可持续发展具有十分重要的意义［23］。木质素是由木质素的3种单体（S、G、H）在酶的催化下聚合而成［24］。木质素单体交联结构的表征，对于木质素的高值化利用意义深远。有研究表明，高浓度稀释的木质素单体溶液与缓冲的H2O2溶液缓慢混合后在辣根过氧化物酶的催化下，即可启动成聚合过程［25］。本研究正是利用这一原理制备的标品。另外，本研究所使用的小麦茎秆前期处理方法，可以有效的去除茎秆中的色素、脂肪酸等基质干扰物质，降低检测时样品基质成分和目标化合物在电喷雾离子源进行离子化时相互竞争等的基质效应。

UPLC是具有小颗粒填料（＜ 2 μm）和超高压系统（＞ 105 kPa）两大特征的超高效液相色谱，具有更加高效和快速的色谱分离性能，由于其高灵敏度和精确度应用于越来越多的领域［26-27］。因此，利用UPLC-MS/MS测定小麦茎秆中木质素单体的交联结构较为精确。前人研究表明，小麦茎秆中S和G单体的含量显著高于H单体的含量［28-29］。本研究测得的小麦茎秆中木质素单体交联结构主要以S和G单体间的连接键含量最多。证实了本研究的准确性。

4 结论

利用UPLC-MS/MS开发了一种定性定量分析小麦茎秆中9种木质素单体交联结构的方法。该方法专一性强、灵敏度高、通量高，结果客观易于分析。