烟草NtCBT基因启动子酵母单杂诱饵载体构建及互作蛋白筛选

余婧 杨慧 余世洲 赵会纳 郑庆霞 王兵 雷波

（1.贵州省烟草科学研究院 烟草行业烟草分子遗传重点实验室，贵阳 550081；2.中国烟草总公司郑州烟草研究院，郑州 450001）

转录因子（transcription factors，TFs）是一类能特异识别并结合靶基因启动子顺式作用元件的蛋白质，可调控靶基因以特定的强度在不同时间或空间表达［1-3］。烟草类西柏烷是一类在烟草分泌型腺毛中特异合成及分泌的代谢物，主要为α-和β-西柏三烯二醇［4-5］，研究表明西柏三烯二醇具有抗病毒、神经保护等作用，在医学领域具有潜在应用价值［5-6］。此外，栽培烟草经调制、陈化后，类西柏烷则进一步降解为茄酮等与烟草香气密切相关的物质［4-5，7］。烟草类西柏烷的生物合成主要包括两个步骤：（1）前体物质牻牛儿牻牛儿基焦磷酸（geranylgeranyl diphosphate，由GGPP基因编码）在西柏三烯一醇合酶（cembratrienol synthase，由CBT基因编码）的催化下环化，生成α-和β-西柏三烯一醇［8-9］；（2）在细胞色素P450加氧酶（cytochrome P450 hydroxylase，由CYP71D16基因编码）催化下，α-和β-西柏三烯一醇氧化生成α-和β-西柏三烯二醇［9-10］。虽然烟草类西柏烷生物合成途径及相关结构酶基因已较为清楚，但有关分子调控机制的报道较少。

酵母单杂交（yeast one-hybrid，Y1H）是一项在酵母细胞内研究蛋白与核酸相互作用的技术，可通过酵母cDNA文库的筛选，获得与靶基因启动子结合的蛋白质［11-13］，科研人员已采用该技术经识别并鉴定出许多与目的核酸序列相结合的蛋白质，余玉珍等［14］通过酵母单杂技术获得了与甲基酶编码基因（CYP82E4）启动子相结合的锌指蛋白转录因子，推测该蛋白通过调控CYP82E4的表达，进而影响烟草去甲基烟碱的合成。宋国琦等［15］构建了拟南芥球形胚时期种子的酵母文库，并从中筛选到与胚柄特异基因G564启动子相结合的22个结合蛋白。Spyropoulou等［16］为了鉴定番茄腺毛中调控萜烯生物合成的蛋白，将芳樟醇合成酶基因（SlTPS5）启动子构建诱饵载体，并从番茄腺毛cDNA酵母文库中筛选到与SlTPS5启动子互作的转录因子SlEOT1。

为筛选与NtCBT基因启动子结合的转录因子，解析烟草类西柏烷生物合成的分子调控机制，从栽培烟草K326基因组中克隆NtCBT基因的启动子序列［17］，并将启动子区域-612 - 0 bp、-499 - 0 bp序列构建诱饵载体进行酵母单杂自激活实验，结果表明，二段序列均存在自激活现象（本研究未展示），不能进行下一步的酵母单杂筛库实验。为筛选出与NtCBT基因启动子相结合的转录因子，本实验将该基因起始密码子ATG 5′端上游-929 - +10 bp区域进一步截为6个片段分别进行自激活实验，并将没有自激活的区域之一：P5（-279 - -119 bp）作为诱饵载体，从烟草腺毛cDNA文库中筛选与NtCBT基因启动子互作的结合蛋白，旨在为进一步挖掘及鉴定烟草类西柏烷合成途径的调控基因、解析其合成的分子调控机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 栽培烟草K326（Nicotiana tabacum L.）。

1.1.2 实验试剂 酵母单杂交试剂盒Matchmaker Gold Yeast One-Hybrid Library Screening System、Y1H Gold酵母菌、酵母转化试剂盒Yeastmaker Yeast Tranformation System 2、酵母培养基、金担子素（aureobasidinA，AbA）、酵母菌落PCR检测试剂盒Matchmaker Insert Check PCR Mix 1购自美国Clontech公司；酵母质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；限制性内切酶BstB I购自美国NEB公司；烟草腺毛cDNA酵母文库于本实验室保存，文库库容为2.6×106CFU；引物、基因合成及测序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.1.3 启动子顺式作用元件分析 采用在线网站PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）、PlantPAN3.0（http://plantpan.itps.ncku.edu.tw/）预测NtCBT基因启动子中的转录因子结合 motif。

1.2 方法

1.2.1 pBait-AbAi重组诱饵载体构建 将NtCBT基因启动子-929 - 10 bp分为6 个区域（P1 ：-929 --750 bp，P2 ：-769 - -590 bp ，P3 ：-609 - -430 bp，P4 ：-449 - -270 bp，P5 ：-279 - -119 bp，P6 ：-129 -10 bp），通过基因合成的方法，将目的片段构建成3个串联重复，连接至酵母单杂诱饵载体pBait-AbAi，并将重组诱饵载体pAbAi-Px分别命名为 ：pAbAi-P1、pAbAi-P2、pAbAi-P3、pAbAi-P4、pAbAi-P5、pAbAi-P6。

1.2.2 诱饵载体线性化及转化酵母Y1H Gold 参照Matchmaker Gold Yeast One-Hybrid Library Screening System说明书中的方法，采用内切酶BstB I分别将6个pAbAi-Px重组质粒单酶切线性化，将1 μg线性化后的质粒转化到Y1H Gold酵母感受态细胞中，涂布SD/-Ura固体平板，30℃培养3-5 d后挑取单菌落，采用Matchmaker Insert Check PCR Mix 1试剂盒进行PCR菌落反应，若扩增出一段约1.35 kb+X的片段，表明诱饵质粒成功整合到酵母Y1H Gold基因组中，即为诱饵菌株Y1H［pAbAi-Px］。

1.2.3 重组诱饵载体对AbA的敏感性 从SD/-Ura平板上挑取整合成功的酵母单菌落，用0.9% NaCl溶液悬浮菌落并将OD600调至0.002（即每100 μL中包含2 000个细胞），各取100 μL菌液涂布以下培养基：SD/-Ura、SD/-Ura/AbA（200 ng/mL）、SD/-Ura/AbA（500 ng/mL）、SD/-Ura/AbA（800 ng/mL）、SD/-Ura/AbA（1 000 ng/mL），30℃培养 3-5 d后观察酵母菌落的生长情况，以确定各重组诱饵载体对AbA的敏感性。

1.2.4 酵母单杂交cDNA文库筛选 取烟草腺毛cDNA酵母文库质粒10 μg，按照Matchmaker Gold Yeast One-Hybrid Library Screening System的说明书进行酵母单杂筛库实验。在质粒导入酵母诱饵菌株后，取转化后的重悬菌液150 μL，涂布到含有相应浓度AbA的SD/-Leu固体平板，30℃培养3-5 d，此时单克隆大小为1-2 mm，初筛完成；将初筛平板上长出的阳性克隆转移到相同的筛选培养基，进行二次筛选。30℃培养3-5 d后，提取阳性克隆的质粒进行PCR反应，PCR产物送生物公司测序。

2 结果

2.1 pAbAi-Px重组诱饵载体自激活

采用BstB I将重组诱饵载体pAbAi-Px单酶切线性化，电泳结果如图1所示，酶切成功的质粒电泳呈单一条带，且条带比未酶切的质粒条带略大，说明6个载体均成功线性化。将线性化载体转化Y1H Gold酵母菌感受态，鉴定为阳性后，取菌液涂布到含有相应浓度AbA的SD/-Ura平板，5个诱饵菌株Y1H［pAbAi-P1］-Y1H［pAbAi-P5］在 含 有 SD/-Ura/AbA（200 ng/mL）的培养基上均不能正常生长（图2），说明这5个诱饵菌株对AbA的敏感性为200 ng/mL。而对于Y1H［pAbAi-P6］诱饵菌株，当AbA浓度加至1 000 ng/mL时，仍不能抑制住酵母的生长（图3）。重组诱饵载体pAbAi-P1-P5在200 ng/mL AbA的存在下无自激活，可采用这5个载体进行下一步的酵母单杂筛库实验；而Y1H［pAbAi-P6］诱饵菌株在含有1 000 ng/mL AbA的SD/-Ura平板上仍能生长，说明pAbAi-P6存在着强烈的自激活，不能用作酵母单杂筛库的诱饵载体。

图1 重组诱饵载体pAbAi-Px线性化Fig.1 Linearization of recombinant bait vector pAbAi-Px

图2 pAbAi-Px诱饵载体自激活Fig.2 Self-activation of pAbAi-Px bait vector

图3 pAbAi-P6诱饵载体自激活Fig.3 Self-activation of pAbAi-P6 bait vector

2.2 P5区域转录因子结合motif预测及pAbAi-P5重组诱饵载体PCR鉴定

选取构建好的pAbAi-P5诱饵载体做进一步的酵母单杂筛库实验，首先预测P5区域中的转录因子结合motif，结果如图4所示，PlantCARE及Plant-PAN3.0均预测到P5区域中存在一个MYB转录因子结合的核心motif：CAGTTA；另外，PlantPAN3.0还预测到P5区域中存在着AP2/ERF转录因子结合motif：AGCTA、ATTTA；bHLH转录因子结合motif：ATGCGTGG、ATACGATT；以及HD-ZIP转录因子结合motif：CAATTATAG。按照2.1中的实验，从SD/-Ura平板上挑取生长健康的Y1H［pAbAi-P5］单菌落，使用Matchmaker Insert Check PCR Mix 1试剂盒进行PCR菌落反应，如图5所示，扩增获得一段约1.84 kb（1.35 kb+0.49 kb）片段，表明诱饵载体成功转入酵母基因组，可以进行下一步的酵母单杂筛库实验。

2.3 酵母单杂交cDNA文库筛选

将Y1H［pAbAi-P5］作为诱饵菌株，在烟草腺毛cDNA酵母文库中筛选与NtCBT基因启动子P5区域互作的结合蛋白。在SD/-Leu/AbA（200 ng/mL）平板的初筛中，共获得50个1-2 mm的阳性酵母菌落（图6，展示部分菌落），将这50个阳性克隆在相同培养基上进行二次点种筛选，最终获得49个阳性克隆（图7）。提取阳性克隆的酵母质粒，使用通用引物进行PCR反应，部分PCR结果如图8所示，其片段长度在400-2 500 bp之间，随后将PCR产物送公司测序。

图6 NtCBT基因启动子P5区域结合蛋白的初筛Fig.6 Preliminary screening of binding protein interacting with P5 regions of NtCBT promoter

图7 NtCBT基因启动子P5区域结合蛋白的二次筛选Fig.7 Secondary screening of binding protein interacting with P5 regions of NtCBT promoter

图8 部分阳性菌落的PCR检测Fig.8 Identification of partial positive colonies by PCR

2.4 阳性克隆测序和分析

将测序结果在NCBI上进行Blast比对，结果显示，ID为XP_016475182.1的蛋白在阳性克隆测序结果中出现9次，该蛋白注释为BURP domain protein RD22-like isoform X1；ID为 XP_019247962.1的蛋白出现7次，注释为功能未知的蛋白。去掉多余及重复的基因，共获得35个可能与NtCBT基因启动子P5区域结合的蛋白，包括XP_009798273.1、XP_009780978.1等5个功能未知的蛋白，以及注释 为 calcineurin B-like protein 10、protein BPS1，chloroplastic-like、GDP-L-galactose phosphorylase 1-like等27个蛋白。另外，还筛选到3个推定的转录因子，分别为HD-ZIP蛋白家族的ANL2（homeobox-leucine zipper protein ANTHOCYANINLESS 2-like isoform X2，XP_009602857.1）、ML1（homeobox-leucine zipper protein MERISTEM L1-like，XP_009799795.1） 以 及NF-Y蛋白家族的NF-YA3（nuclear transcription factor Y subunit A-3-lik，XP_016441195.1），这3个转录因子可能与NtCBT基因启动子的P5区域存在着潜在的结合关系。

3 讨论

通过酵母单杂交cDNA文库筛选通常可获得与靶基因启动子结合的蛋白质，进一步分析获得候选转录因子［11］。对烟草类西柏烷生物合成途径中的结构酶基因CBT、CYP71D16已有广泛的研究［5，9-10］，然而，有关该途径的调控基因及分子调控机制研究较少，为了获得调控烟草类西柏烷生物合成的转录因子，将NtCBT基因启动子截为6个区域并分别进行酵母单杂诱饵载体自激活实验，结果表明，除P6区域外，另外5个区域（P1-P5）在SD/-Ura/AbA（200 ng/mL）平板中均无自激活现象。根据Ennajdaoui等［9］在林烟草中的实验，CBT基因启动子中的P5区域（-279 - -119 bp）是决定CBT基因在烟草腺毛特异表达的关键区域，但与之结合的蛋白未知，因此，选择P5区域进行酵母单杂筛库实验。经筛选，获得3个转录因子，分别是HD-ZIP以及NF-Y蛋白家族成员。在对NtCBT基因启动子P5区域的转录因子结合motif进行分析时，预测到MYB、AP2/ERF、bHLH、HD-ZIP转录因子可通过CAGTTA、AGCTA、ATGCGTGG、CAATTATAG 等motif结合到P5区域上，然而，在我们的筛库结果中，仅筛到了HD-ZIP蛋白成员，以及一个没有预测到的NF-Y蛋白，转录因子MYB、AP2/ERF及bHLH在本次筛库中没有筛到，这可能是在酵母单杂筛库实验中，存在着一定程度上的漏筛［3］。另外，在我们的实验中，NtCBT基因启动子的P1-P4四个区域在SD/-Ura/AbA（200 ng/mL）平板上均无自激活现象，进一步可将这4个诱饵载体从文库中筛选与NtCBT基因启动子相结合的其它转录因子。

M：Marker；泳道1，2：菌落PCR扩增产物M：Marker.Lane 1 and 2：PCR-amplified products

本次筛库获得的ANL2、ML1蛋白均属于HDZIP转录因子的IV亚家族成员，主要参与表皮细胞分化、角质的生物合成、表皮细胞花青素积累，如拟南芥ANL2基因跟表皮层中花青素的组织特异性积累有关［18］，番茄的CD2是ANL2的同源基因，参与表皮角质层蜡的生物合成［19］；棉花GbML1基因在拟南芥中表达后影响表皮毛的数量及花青素的积累［20］。NF-YA3属于NF-Y转录因子的NF-YA亚家族成员［21］，参与植物开花的分子调控［22］、果实成熟及糖分积累［23-24］、以及响应生物及非生物胁迫等生物学功能［21］。然而，目前未见相关报道说明这些转录因子是否参与了烟草类西柏烷合成的表达调控。鉴于筛库结果，推测3个转录因子ANL2、ML1、NF-YA3可能与NtCBT基因启动子相结合，调控NtCBT基因的表达，进而参与烟草类西柏烷的生物合成，下一步需要过表达、干涉表达等实验验证其功能。

4 结论

通过烟草腺毛单杂交cDNA文库筛选，获得3个与NtCBT基因启动子P5区域相结合的转录因子，分别是HD-ZIP蛋白家族的ANL2、ML1以及NF-Y蛋白家族的NF-YA3，这3个转录因子可能通过调控烟草NtCBT基因的表达进而参与类西柏烷的生物合成过程。