利用真空渗透和CRISPR/Cas9系统获得非转基因菜薹突变体

宗梅 韩硕 郭宁 段蒙蒙 刘凡 王桂香

（北京市农林科学院蔬菜研究所 农业农村部华北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室 蔬菜种质改良北京市重点实验室，北京100097）

随着转基因技术的发展，转基因生物安全问题越来越引发人们的关注，这也是决定转基因技术能否广泛应用的关键问题。基于CRISPR/Cas9的基因编辑技术在创制无外源片段插入的非转基因突变材料方面具有很大的潜力。通常可以通过对转基因后代有性繁殖分离和标记选择去除含Cas9/sgRNA的外源载体，并保留编辑突变的方法获得安全的非转基因改良材料。同时，CRISPR/Cas9技术也提供了无需后代分离而直接获得非转基因突变株的可能。如农杆菌介导的Cas9的瞬时表达［1-2］，及Cas9/sgRNA核糖核蛋白复合物（ribonucleoprotein complex，RNP）直接应用于原生质体转化等［3-5］。然而，无论原生质体还是离体转化都要依赖于组织培养，受受体材料基因型和外植体类型的再生能力限制，导致转化不成功、效率低，及转化体系不稳定等问题。因此，研究不依赖于组织培养的方法，通过CRISPR/Cas9基因编辑系统直接创制非转基因突变体具有重要的应用价值。

白菜（Brassica campestris）是十字花科芸薹属的大众蔬菜种类之一，自交不亲和性较强，需要长时间的春化才能开花，利用物理或化学诱变剂诱导突变和创造新种质的难度较大［6］。基于组织培养的传统转基因研究表明，白菜的外植体出芽困难、转化效率低，造成其转化技术研究进展缓慢［7-9］，也阻碍了CRISPR/Cas9技术在白菜中的广泛应用。

农杆菌介导的浸花法（floral-dip）是一种不依赖组织培养的转基因方法，避开组织培养和离体再生，直接获得转基因的种子，方法简单，省时省力，该技术已广泛应用于拟南芥。很多学者也利用经过改良的floral-dip方法对白菜进行原位转化研究，并取得了一些可喜进展，尤其在与拟南芥亲缘关系较近的芸薹属植物中取得了一些成果。张广辉等［10］和Liu等［11］通过真空渗入原位转化法对白菜和油菜成功进行转化，为芸薹属蔬菜遗传转化提供了一条新途径。严继勇［12］采用真空抽滤转化法对大白菜进行了转化，付绍红［13］对甘蓝型油菜浸花法转化进行了系统研究。Xu 等［14］、He等［15］和 Chen 等［16］分别报道了真空转化法在芸薹属小白菜、甘蓝型油菜和乌塌菜转化中的成功应用，但原位转化效率相对较低，为0.01%左右。

菜薹又称菜心（Brassica campestris L.ssp.chinensis），为不结球白菜类型中以幼嫩花茎为主要食用器官的一个常规栽培品种，播种至产品收获需40-60 d，无需春化，生育期短，是研究白菜类蔬菜原位转化技术的好材料。目前虽有菜薹原位转化和CRISPR/Cas9基因编辑体系应用的相关报道［17-18］，但是尚未有将原位转化和CRISPR/Cas9技术相结合创制菜薹非转基因突变株的相关报道。

本研究通过真空渗入结合农杆菌浸花法，拟实现CRISPR/Cas9体系在菜薹原位转化中的应用，并通过Cas9和gRNA的瞬时表达，获得无外源片段插入的非转基因植株，旨在为无选择标记的基因编辑技术应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

试验于2020年3-5月、8-10月在北京市农林科学院蔬菜研究所温室进行，供试材料为早熟菜薹商品种‘49菜心’。种子分批播种在温室营养钵中，约40 d后，开花植株达到50-60 cm，进行后续转化处理。

1.2 方法

1.2.1 载体构建 CRISPR/Cas9介导的基因编辑载体pBSE401［19］，由中国农业大学陈其军教授课题组惠赠，北京市农林科学院蔬菜研究所田守蔚老师对载体进行了Bar选择标记改造。依照Tian等［20］方法构建载体，将等体积100 μmol/L的引物PDS-F和PDS-R（表1）混合，95℃孵育5 min，缓慢冷却至室温。由于2条引物靶点序列的互补配对和引物两端添加的接头，得到一个带有Bsa I酶切末端的双链DNA片段，可以与pBSE401载体上的Bsa I酶切位点切割并连接。因此可利用Bsa I和T4连接酶（New England Biolabs，Ipswich，MA，USA）将此DNA短片段组装到pBSE401载体上。

1.2.2 真空渗透法转化菜薹植株 按照He等［15］方法进行菜薹浸花原位转化。用一个含有20 L农杆菌悬浮液的干燥器，将植株整个花序浸入农杆菌悬浮液中，用连接到干燥器的真空泵抽真空，使干燥器内部形成负压环境，压力约104Pa，持续5 min；随后打开控制阀，使处理器内压力慢慢恢复正常，再次抽真空（约104Pa，持续5 min）。从干燥器中取出处理后的植株，移载至温室中，并进行人工授粉，收获种子。

1.2.3 转化菜薹种子苗的初步检测 用于转化的pBSE401载体携带除草剂草丁膦抗性基因Bar，Bar检测试纸条（a07-13-413北京奥创生物有限公司，中国北京）可以快速检测极微量的Bar蛋白。鉴于测试样品较多，采用了混合样品测定，用打孔器取直径0.5 cm的鲜嫩叶片，每30株为一组，混合放入研钵中，加入20 mL的ddH2O，研磨成汁，用Bar试纸测试液体。如果混合样本产生阳性结果，则可以通过减少混合样本数量来找到目标阳性单株。

1.2.4 基因编辑植株的分子鉴定 使用植物DNA小提试剂盒（Qiagen，CA）提取菜薹基因组DNA，用设计的Cas9和gRNA特异引物进行PCR扩增，引物PDS-1和PDS-356扩增包含靶点区的PDS基因片段，所用引物具体序列见表1。纯化PCR产物测序，对测序结果显示PDS基因发生编辑的PCR样品进行克隆，随机选取单克隆20个，进行单克隆测序。

表1 本研究使用的引物Table 1 Primers used in this study

2 结果

2.1 基因编辑靶点选择与载体构建

八氢番茄红素脱氢酶（PDS）作为类胡萝卜素生物合成途径的关键酶，是叶绿素合成所必须的。PDS基因的敲除会使植株产生白化性状，便于识别。因此，选取白菜PDS基因为靶基因，其在NCBI（National Center for Biotechnology Information） 数 据库的基因编号为：103863556。如图1-a所示，‘49菜心’的PDS基因含4个外显子，第一外显子最末端的序列选为靶点gRNA，图中用下划线序列标识，红色字体序列CCC（互补序列为GGG）表示PAM（protospacer adjacent motif，NGG）区，将靶点gRNA克隆到pBSE401载体上（图1-b），经测序验证正确，完成基因编辑载体构建。

2.2 种子苗的转化鉴定

利用农杆菌EHA105介导，通过真空渗透浸花法转化‘49菜心’花芽。分3批共转化菜心25株，收获种子2 000余粒。将获得的种子播种后，得到2 032株种子苗。首先用Bar试纸条对这些幼苗进行抗性检测，结果显示，2 032株幼苗中只有一株（#1）阳性苗。提取其DNA进行外源载体的PCR检测，可以扩增出Cas9和sgRNA条带。

2.3 表型及基因编辑鉴定

#1阳性植株的表型与野生型一致，没有表现出PDS基因敲除应该表现的白化、矮小等性状。但有2株（#2和#3）表现出明显矮小、白化的表型（图1-d），表明其PDS基因可能发生敲除突变。提取白化幼苗#2和#3的DNA，未能检测到Cas9和sgRNA的载体片段。对#1、#2和#3植株的PDS基因进行扩增和基因编辑鉴定，结果（图1-c）表明，这3株植株的PDS基因靶点区域均发生多峰变化。单克隆测序结果进一步显示#1植株的PDS基因发生杂合编辑，野生型等位基因保留；而#2和#3植株的PDS基因靶点区均发生了不同类型的插入或缺失突变（图1-e），未检测到野生型等位基因。

图1 利用CRISPR/Cas9系统通过真空渗透原位转化获得菜薹PDS突变体Fig.1 CRISPR/Cas9-mediated gene editing and vacuum infiltration in planta transformation to creates PDS mutants in B.campestris

3 讨论

利用CRISPR/Cas9技术，不经过组织培养直接获得非转基因突变体具有重要的研究价值。本研究以敲除PDS引起的白化表型作为可视标记，获得2株没有任何外源筛选标记的菜心突变体和1株有外源载体插入的编辑株。2 032株幼苗中有3株发生基因编辑突变，突变率为0.15%，远高于前人报道的通过真空渗透法进行的有外源序列插入的植株转化效率（0.01%）［7，10，14-15］。本研究结果显示，真空渗透原位转化可以不经过植物组织培养实现基因编辑。农杆菌介导的基于CRISPR/Cas9基因编辑系统，通过真空渗透瞬时表达可以产生多等位基因、无外源片段插入的突变体。该方法适用于芸薹属蔬菜，并且可为其他作物，特别是杂合和多年生作物的基因编辑提供参考。

在实际应用中，绝大多数用于作物改良所需的突变不会在发育早期表现出可视的表型。如果不能简单地从植物的表型中确定目标基因控制的性状，或者如本研究中#1植株，目标基因发生了杂合突变，未能产生可见表型，将会给突变株鉴定带来困难。现有检测方法是在一定数量样本的混合物中鉴定编辑突变，然而这种方法的有效性取决于样本的数量和突变效率。如果样本数量非常大，突变效率较低，则需要更有效的检测方法。Chen等［1］报道了利用两步法通过高通量测序筛选一定数量混合群体，并通过高分辨率溶解曲线分析鉴定突变个体，这种方法可尝试用于本研究中的突变体鉴定。相信随着现有技术的发展，在大样本量中检测突变个体会越来越经济、快速和准确。

4 结论

不经过组织培养的真空渗透原位转化可以在菜薹中实现基因编辑。外源载体没有整合到植物的基因组中，通过瞬时表达CRISPR/Cas9系统，获得无标记的非转基因菜薹突变体。