银杏GbR2R3-MYB1基因的克隆及非生物胁迫应答分析

骆鹰 谭智 王帆 刘晓霞 罗小芳 何福林

（1.湖南科技学院化学与生物工程学院，永州 425199；2.湖南省银杏工程技术研究中心，永州 425199；湖南省生物质资源综合开发利用工程技术研究中心，永州 425199）

转录因子（transcription factors，TF）又称反式作用因子，能够与位于基因启动子序列上的顺式作用元件相互作用，通过转录因子之间，或与其它相关蛋白间的特异性结合从而激活或抑制某些基因的转录［1］。高等植物中转录因子一般由DNA结合功能域、寡聚化位点、转录调控区及核定位信号区等组成［2］。植物中的MYB转录因子成员数量较多，且大多数成员的N末端都含有保守MYB结构域，该结构域由1-4个不完全重复序列R组成，每个R片段含有50-53个保守的氨基酸残基。根据MYB结构域所含R重复序列数量可分为：R1-MYB（1R）、R2R3-MYB（2R）、R1R2R3-MYB（3R） 和 4R-MYB（4R），其中植物中以R2R3-MYB为主要群体［3-4］。研究发现，R2R3MYB能参与植物的生理生化，次生代谢，生长发育，激素合成及信号转导，以及响应生物和非生物胁迫过程等［4-8］。拟南芥（Arabidopsis thaliana）中的AtMYB15可以通过调控CBF基因参与抗寒和抗冻性，mby15突变体能够增强拟南芥的抗冻性，而过表达则降低其抗冻性［9］；MYB80和MYB124可以通过影响CBF基因的表达来增强苹果的抗寒与抗冻性［10］。水稻（Oryza sativa）OsMYB30也是对冷敏感的MYB家族成员之一，过表达OsMYB30可以增强水稻对冷敏感程度，而myb30突变体植株则表现出较强的耐寒性［11］。AtMYB30突变体对热应激、氧化应激比较敏感，MYB30能与ANN4和ANN1启动子结合并下调其表达，从而通过Ca2+信号来调节热激、氧化反应［12］。高温胁迫下过表达水稻OsMYB55株系总氨基酸含量较高，可以使营养期水稻植株的耐热性增强［13］。过表达玉米（Zea mays）中的MYB55基因，也可以增强玉米的耐热性［14］。菠萝（Ananas comosus）中 MYB 家族成员能响应一种或多种非生物胁迫，例如Aco014614只受冷胁迫诱导，而Aco001113可以受高盐、干旱和热胁迫诱导，其中，Aco007733在高盐、干旱、冷、热胁迫、ABA、MeJA、SA、2,4-D八种条件处理下均被诱导表达，提示其是一种多重抗性调节因子［15］。

银杏（Ginkgo biloba）是我国独特的珍稀孑遗树种，别名“公孙树”，最早出现在2.7-3.5亿年前，地球上的生命经过巨大的变动后，唯有银杏依然保持其最初的自然生态风貌，常被业内人士比喻为植物界的“大熊猫”，现如今广泛分布在世界各地。银杏具有多种价值和用处，如医药、食品、生态、观赏和木料等方面，尤其社会经济价值和生态利用价值极高［16］。银杏在医药和生态学上的价值是由其叶片和果实中的活性成分所共同赋予，主要涉及黄酮类、酚类、萜内酯以及多糖和生物碱类等化合物。黄酮类化合物也被称作黄碱素，大部分结合糖形成苷类，对植物的各种生命活动是不可或缺的，在各种植物的许多器官和组织中广泛存在，其中在银杏叶片含量较高。大多数银杏品种的黄酮含量在1.4%-1.9%之间［17］，银杏黄酮类化合物在植物的生长发育生物过程、抗逆性等多个方面起着十分重要的作用，对于人类而言，其药用和食用价值也很高，在医药卫生行业具有十分广阔的开发空间。近年来，高通量测序及分子生物学技术在银杏生物学功能研究中得到广泛运用，人们对银杏有了更深入了解，然而有关银杏R2R3-MYB1转录因子的研究报道很少。本研究基于NCBI及生物信息相关数据库，从银杏叶片中克隆得到银杏GbR2R3-MYB1转录因子，并对其进行生物信息学、亚细胞定位及逆境胁迫下的表达分析，为进一步研究银杏R2R3-MYB转录因子的功能奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 本研究所用实验材料来源于湖南省永州市桐子坳银杏成年植株以及收集同株银杏的种子，地理坐标为北纬 26°06′，东经 111°50′。采集地上自然脱落的果实置于室温下，待果实腐烂后，去除种皮与果实，将种子清水洗干净后晾干，用湿沙搅拌均匀放置在通风阴凉处，让其自然层积。将沙藏种子洗净，选取沉在水底饱满良好的种子，用KMnO4溶液（1 000 mg/L）消毒时间为15 min，再用无菌蒸馏水冲洗5-6次。最后将处理的种子播种于装有基质的培养盆中，35℃人工气候箱中黑暗培养催芽，待银杏种子长出白色嫩芽时进行光照培养（昼夜温度为28℃/18℃，空气相对湿度为75%，光照周期为18 h光照/6 h黑暗）。待银杏幼苗长出4叶时，分别进行盐、干旱、低温和高温逆境胁迫处理。处理条件设置为：用浓度为300 mmol/L的NaCl溶液模拟盐胁迫，20%的聚乙二醇（PEG6000）溶液模拟干旱胁迫，以4℃和42℃人工气候箱分别模拟低温和高温胁迫。上述处理均以在培养盆常温下正常生长的银杏幼苗为对照。4种非生物胁迫各处理的时间分别为：0 h、2 h、4 h、8 h、12 h和24 h。每处理3次生物学重复，分别将同一胁迫处理时间采集的银杏幼苗液氮速冻后，置于-80℃冰箱保存备用。

1.1.2 菌株和载体 本研究中使用的DH5α感受态细胞、pClone007 Blunt Vector Kit载体由北京擎科公司提供；pCAMBIA1300-GFP质粒及GV3101农杆菌感受态细胞购自于武汉大智众成公司。

1.1.3 主要试剂 限制性内切酶、总RNA提取、荧光定量PCR、琼脂糖DNA胶回收、cDNA第一链合成、琼脂糖DNA回收及质粒提取试剂盒由北京天根公司提供；无缝克隆试剂盒、引物及PCR扩增高保真酶由北京擎科公司提供；Xba I、Kpn I高保真酶购自于武汉大智众成公司。

1.2 方法

1.2.1 总RNA提取及cDNA合成 取新鲜银杏幼苗叶0.1 g，参考北京天根公司总RNA提取试剂盒相关步骤抽提总RNA，并将样本保存-80℃冰箱备用。取2 000 ng总RNA，根据天根公司FastKing cDNA第一链合成试剂盒说明，进行cDNA第一链合成反转录实验，合成产物保存于-20℃冰箱待用。

1.2.2 GbR2R3-MYB1基因克隆 通过NCBI官网（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）查询银杏GbR2R3-MYB1基因（登录号：ASR18086.1），从而获取GbR2R3-MYB1的CDS、全基因组、cDNA及氨基酸序列。以银杏幼苗叶片为材料，以逆转录合成的cDNA为模板，通过PCR扩增进行GbR2R3-MYB1基因克隆。运用Primer Primer5.0软件设计本研究所用特异性引物（引物具体信息见表1），GbASR基因克隆及pCAMBIA1300-GbR2R3MYB1-GFP融合表达载体构建具体过程，参考骆鹰等［18］相关基因克隆操作方法与步骤。

表1 实验所用引物序列信息Table 1 Primer sequences used in this study

1.2.3 生物信息学分析 通过NCBI官网CDD（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）在线工具对GbR2R3-MYB1进行保守结构域分析；利用Expasy ProtParam（https://web.expasy.org/ protparam/） 进 行蛋白理化性质预测，SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）进行蛋白二级结构预测，SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/）进行蛋白三级结构预测；通过Expasy Protscale（https://web.expasy.org/protscale/） 进行亲疏水性分析；通过NCBI中BLAST搜索其他物种的R2R3-MYB1同源蛋白序列，并利用DNAMAN软件进行多重序列比对分析；利用MEGA6.0软件中邻近法（neighbor joining，NJ）构建系统进化树。

1.2.4 GbR2R3-MYB1基因亚细胞定位 按照谢旻等［19］有关亚细胞定位步骤操作进行GbR2R3-MYB1蛋白亚细胞定位检测试验。利用基因克隆方法获得GbR2R3-MYB1目的片段，用Xba I和Kpn I高保真酶对质粒pCAMBIA1300-GFP进行酶切，并将目的片段GbR2R3-MYB1与pCAMBIA1300-GFP载体酶切片段进行体外连接，从而构建重组载体pCAMBIA1300-GbR2R3MYB1-GFP。对冻存的GV3101菌种进行复苏，并制备感受态细胞。采用冷却法将重组融合表达载体转化至GV3101农杆菌感受态细胞，通过摇菌、涂板、挑选阳性单克隆等过程，然后进行菌落PCR。将阳性单克隆菌液送北京擎科公司进行测序，并用正确的阳性单克隆菌液提取质粒，以便备用。

将含有重组融合表达载体pCAMBIA1300-GbR2R3MYB1-GFP的农杆菌进行过夜培养后，移入LB液体培养基中（含有Kan和Rif），摇床培养16 h，温度控制28℃，再加入浓度为100 mmol/L的乙酰丁香酮和0.5 mol/L的吗啉乙磺酸（MES）。常温4 000 r/min条件下，菌液离心10 min，然后弃除上清液，用MgCl2溶液重新悬浮菌体，加入浓度为100 mmol/L的MAS进行混匀，静置3 h，用于后续试验侵染液。选取正在生长期的烟草叶片，用针头在叶片背面扎数个小孔，然后用注射器吸入侵染液，将其从叶片下表皮注射到烟草叶片内，注射后烟草叶片会出现湿润现象，作为处理组。以转入空载体的烟草叶片作为对照组。注射后72 h，取样置于激光共聚焦荧光显微镜检测荧光信号。GFP激发光为488 nm，DAPI激发光为405 nm。

1.2.5 GbR2R3-MYB1基因表达分析 通过上述1.1.1植物材料和1.2.1总RNA提取及cDNA合成步骤，获得银杏幼苗叶片总RNA和cDNA，用于逆境胁迫下GbR2R3-MYB1基因的表达情况分析。荧光定量qPCR的总反应体系、扩增条件、样品处理及相对表达量的计算方法参考骆鹰等［18］相关基因表达实验操作方法及步骤。

2 结果

2.1 银杏GbR2R3-MYB1基因克隆及序列分析

以银杏叶片cDNA为模板，利用目的基因特异性引物进行PCR扩增，将获得GbR2R3-MYB1目的片段PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，出现单一DNA条带，片段大小介于750-1 000 bp，这与本研究预测扩增片段大小一致（图1-A）。在紫外灯下迅速切下与目的片段大小一致的条带，利用DNA胶回收试剂盒，并参考相关说明回收目的片段，连接至pClone007 Blunt Vector Kit载体，转化至DH5α大肠杆菌感受态细胞后，涂板，挑选阳性单克隆，并用pClone007载体引物进行菌落PCR，通过1%琼脂糖凝胶电泳检测（图1-B），将阳性菌液送公司测序。通过DNASTAR软件对阳性克隆测序获得GbR2R3-MYB1核苷酸序列及其所编码的氨基酸序列进行分析，结果显示本研究克隆GbR2R3-MYB1的cDNA长为909 bp，起始密码子ATG和终止密码子TAA分别位于321 bp和1 139 bp处，发现银杏GbR2R3-MYB1的CDS区全长为819 bp。该基因CDS的碱基组成A为28.21%、T为20.63%、G为26.98%、C 为 24.18%，共编码 272 aa（图2）。（A+T）%值是48.84%，低于（G+C）%，推测GbR2R3-MYB1的CDS区的DNA双链比较稳定。

图1 GbR2R3-MYB1基因PCR扩增琼脂糖凝胶电泳Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR amplified products of GbR2R3-MYB1

图2 GbR2R3-MYB1基因CDS区核苷酸序列及编码氨基酸序列Fig.2 Nucleotide and amino acid sequence in the CDS region of GbR2R3-MYB1 gene

2.2 银杏GbR2R3-MYB1的序列比对及系统进化分析

通过NCBI官网对银杏GbR2R3-MYB1的序列进行分析，结果表明GbR2R3-MYB1蛋白具有MYB_DNA-Bingding结构域，位于67-111 aa区域，含有两个典型的SANT结构域，分别位于67-114 aa和69-112 aa区域（图3）。利用在NCBI数据库BLAST比对，下载GenBank收录的12种植物MYB氨基酸序列，通过DNAMAN软件进行多重序列比对（图4），结果发现，银杏GbR2R3-MYB1蛋白与火炬松（Pinus taeda）、白云杉（Picea glauca）MYB蛋白的氨基酸序列相似性最高，分别为67.32%和63.57%；与荷花（Nelumbo nucifera） 和 桃（Prunus persica）MYB蛋白的氨基酸序列相似性较低，分别为54.78%和55.51%。由图5可见，GbR2R3-MYB1蛋白与火炬松（Pinus taeda）、白云杉MYB蛋白聚在一起，它们同属于裸子植物，表明亲缘关系较近。荷花（Nelumbo nucifera）和桃（Prunus persica）MYB蛋白聚在同一分支，它们同属于双子叶植物；玉米（Zea mays）和水稻（Oryza sativa Japonica）属于单子叶植物，它们的MYB蛋白聚在一起，亲缘关系较近。

图3 银杏GbR2R3-MYB1蛋白保守域Fig.3 Conservative domain of GbR2R3-MYB1 protein from G.biloba

图4 银杏GbR2R3-MYB1蛋白与其他植物氨基酸序列的多重比对Fig.4 Multiple alignment of the amino acid sequences of GbR2R3-MYB1 in G.biloba and other plants

图5 植物MYB同源基因氨基酸序列系统进化树Fig.5 Phylogenetic tree of deduced amino acid sequences of plant MYB homologous genes

2.3 银杏GbR2R3-MYB1氨基酸序列的理化性质分析

银杏GbR2R3-MYB1蛋白理化性质通过Protparam软件进行预测分析，结果发现GbR2R3-MYB1由272个氨基酸残基组成，相对分子质量为30 001.60 Da，理论等电点（PI）为6.59，在组成该蛋白的氨基酸中，丙氨酸（Ala）所占比例最高，为9.2%，而蛋氨酸（Met）、色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）所占比例最低，为1.8%。负电荷残基（Asp+Glu）33个，正电荷残基（Arg+Lys）31个。GbR2R3-MYB1的分子式为C1287H2028N392O406S16，不稳定指数为52.10，这表明该蛋白为不稳定酸性蛋白。GbR2R3-MYB1的脂肪族氨基酸指数（aliphatic index）为68.64，总亲水性平均系数（GRAVY）为-0.628，这说明该蛋白是亲水性蛋白（图6）。

图6 GbR2R3-MYB1蛋白亲水/疏水性预测分析Fig.6 Prediction of hydrophilic/hydrophobicity for GbR2R3-MYB1 protein

2.4 银杏GbR2R3-MYB1蛋白的二级、三级结构预测

通过SOPMA在线软件对GbR2R3-MYB1蛋白的二级结构进行预测，结果表明（图7），GbR2R3-MYB1蛋 白 由 28.31%的α-螺 旋、4.78%的β-转角、5.88%的延伸链和61.03%的无规卷曲构成，且α-螺旋主要集中于N端的MYB结构域和C端的功能结构域位置，这与预期结果相一致。利用SWISSMODEL在线软件对GbR2R3-MYB1蛋白三维空间结构进行预测，结果发现（图8），在R2和R3 repeat结构域中均含有3个α-螺旋结构单位，这与二级结构预测结果相一致。

图7 GbR2R3-MYB1蛋白二级结构预测Fig.7 Prediction of secondary structure for GbR2R3-MYB1 protein

图8 GbR2R3-MYB1蛋白三级结构预测Fig.8 Prediction of tertiary structure of GbR2R3-MYB1 protein

2.5 GbR2R3-MYB1蛋白亚细胞定位分析

为了明确GbR2R3-MYB1蛋白的亚细胞定位情况，将克隆获得的GbR2R3-MYB1目的片段成功连接至pCAMBIA1300-GFP载体上，构建融合表达载体pCAMBIA1300- GbR2R3MYB1-GFP，并将其转入烟草幼苗叶片下表皮细胞中进行瞬时表达。以DAPI染剂作为参考，撕取烟草幼苗叶片表皮细胞置于激光共聚焦荧光显微镜观察下观察GFP蛋白在细胞中的表达情况，结果发现（图9），对照组中整个烟草表皮细胞分布较强的绿色荧光信号，而处理组烟草表皮细胞仅细胞核能检测到荧光信号，这表明GbR2R3MYB1基因所编码的蛋白定位于细胞核。

图9 GbR2R3-MYB1蛋白亚细胞定位结果Fig.9 Subcellular localization of GbR2R3-MYB1 protein

2.6 GbR2R3MYB1基因在非生物胁迫下的表达分析

通过RT-qPCR技术对高盐、干旱、低温和高温等非生物胁迫处理下的银杏GbR2R3-MYB1基因表达情况进行检测分析，结果显示，GbR2R3-MYB1受高盐、干旱、低温和高温等非生物胁迫的诱导，在NaCl胁迫处理下（图10-A），GbR2R3-MYB1基因相对表达量呈先上升后下降的趋势，盐胁迫4 h GbR2R3-MYB1基因的相对表达量达最达峰值，而盐胁迫8 h，其表达量达最低值。干旱胁迫2 h，GbR2R3-MYB1的相对表达量最高，而胁迫24 h时，其表达量最低，整体上也呈现先上升后下降的趋势（图10-B）。在低温（4℃）及高温（42℃）处理下（图10-C、D），GbR2R3-MYB1的相对表达量均呈先下降后上升再下降的趋势，低温胁迫12 h时GbR2R3-MYB1相对表达量峰值最高，而高温胁迫8 h，其表达量峰值最高。

图10 GbR2R3-MYB1基因在盐、干旱、低温及高温胁迫下的表达分析Fig.10 Expression analysis of GbR2R3-MYB1 gene under salt，drought，cold，and heat stresses

3 讨论

MYB转录因子家族成员的典型特征是含有比较保守的DNA结合域，本研究通过分子生物学技术克隆得到银杏GbR2R3-MYB1基因，片段大小为819 bp，编码272个氨基酸。根据结构域的不同可以将MYB蛋白家族分为4类，其中R2R3-MYB蛋白是最大一类蛋白家族。本研究通过蛋白序列比对及保守结构域分析，结果确定银杏GbR2R3-MYB1转录因子含有R2、R3结构域，能够与启动子元件结合并发生作用，这为进一步验证银杏GbR2R3-MYB1对下游基因的作用奠定基础。进化树分析表明银杏GbR2R3-MYB1与火炬松、白云杉等植物的R2R3-MYB转录因子亲缘关系比较近，聚在一个分支，这可能是由于它们同属于裸子植物。通常情况下，转录因子定位于细胞核［20］，可以通过调控下游基因而发生作用，如银杏GbERF1转录因子定位于细胞核［21］；西瓜（Citrullus lanatus）ClWRKY54蛋白分布于细胞核［22］；本研究亚细胞定位结果显示，银杏GbR2R3-MYB1转录因子定位于细胞核。然而，一些植物转录因子也可能定位于细胞中的其他位置，如梁山慈竹（Dendrocalamus farinosus）DfMYB3蛋白定位于细胞核和细胞膜［23］；丹参（Salvia miltiorrhiza）SmMYB52［24］、SmMYB87 转录因子［25］在细胞核和细胞膜上GFP都有表达。

植物通过不同的适应调节机制来感知、响应外界各种生物及非生物学胁迫，从而使其生命得以延续。R2R3-MYBs作为MYB转录因子家族数量最多成员，已被证实在植物生长发育及应答非生物学胁迫过程中扮演重要角色。当植物处于盐胁迫环境时，土壤中高浓度盐对大多数植物是有害的，Na+、Ca2+盐对植物的损害更大，尤其是Na+盐［26］。研究发现，棉花（Gossypium hirsutum）GhMYB73受NaCl和ABA诱导，将GhMYB73基因沉默，突变体株系对盐胁迫更加敏感，然而，过表达GhMYB73拟南芥株系苗期耐盐性却显著增强［27］；拟南芥AtMYB2和AtMYB44基因的转录水平受盐胁迫的影响，过表达AtMYB2和AtMYB44拟南芥株系抗盐性明显提升［28-29］；番茄（Solanum lycopersicum）SlMYB102受渗透胁迫，尤其是盐胁迫诱导，过表达SlMYB102番茄株系在长时间盐胁迫下，其生长抑制程度显著降低［30］；花生（Arachis hypogaea）中 AhMYB1、AhMYB2、AhMYB6和AhMYB7基因的表达量在盐胁迫下显著增加［31］；小麦（Triticum aestivum）TaMYB33、TaMYB56-B和TaMYB73基 因 均 受 高盐诱导，过表达这些基因，所获得拟南芥株系对盐的耐受性显著增强［32-34］。已有研究报道，植物R2R3-MYB基因还受干旱诱导，如干旱胁迫后，白羊草（Bothriochloa ischaemum） 根 系 中 BiMYB35、BiMYB142、BiMYB143的表达量上调，促进根部的发育，从而提高其抗旱性［35］；大豆（Glycine max）GmMYB118可以通过促进干旱、盐胁迫相关基因的表达，调节渗透及氧化物质（如脯氨酸、叶绿素、活性氧和丙二醛）含量来维持细胞内稳态，从而增强大豆对干旱、盐胁迫耐受性［36］。本研究表明GbR2R3-MYB1基因受高盐和干旱诱导，其相对表达量在整体上呈先上升后下降的趋势，且GbR2R3-MYB1基因的表达量分别在高盐处理4 h和PEG处理2 h后达到最大峰值，这与上述报道植物R2R3MYB转录因子能应答盐、干旱胁迫结果相符合。

温度是影响植物分布、生长和产量的关键环境因子，近年来，研究人员对植物MYB转录因子应答温度胁迫进行大量的试验研究，发现苹果（Malus×domestica）中MdMYB88、MdMYB124基因分别通过靶向调控MdCSP3和MdCCA1基因的表达，促进花青素积累和降低H2O2毒性以应对寒冷胁迫［37］；过表达MdMYB23转基因苹果愈伤组织和拟南芥株系表现出更强的耐寒性［38］。低温胁迫50 d后，GmMYB76和GmMYB177转基因大豆株系的存活率显著高于野生型，且转基因大豆株系中的脯氨酸含量显著增加［39］。高温胁迫下，过表达R2R3-MYB相关转录因子TT2和MYB5拟南芥植株表现出更强的耐热性，相反，tt2、myb5、tt2/myb5突变体植株则对热激反应更为敏感［40］。小麦幼苗中TaMYB79、TaMYB80、TaMYB81和 TaMYB82基 因的mRNA在40℃热处理1 h后迅速积累［41］。蓝莓（Vaccinium corymbosum）中VcMYB4a是应答非生物学胁迫的重要抑制因子，在盐、干旱、冷胁迫下，VcMYB4a基因的表达下调，但是受极度严寒与热诱导；过表达VcMYB4a愈伤组织会增强对盐、干旱、冷、极度严寒和高温胁迫敏感性［42］。本次研究发现，GbR2R3-MYB1基因的相对表达量在低温、高温胁迫下出现先下调再上升再下调的趋势，表明GbR2R3-MYB1基因参与应答低温和高温胁迫。然而，银杏GbR2R3-MYB1基因参与响应非生物胁迫的分子机制及其信号通路，以及是否影响银杏生长发育等还需进一步研究。

4 结论

克隆获得1个R2R3-MYB转录因子基因GbR2R3-MYB1，其编码区长度为819 bp，编码272个氨基酸，其相对分子量大小为30 001.60 Da，编码蛋白为不稳定亲水蛋白，定位于细胞核；GbR2R3-MYB1蛋白二级结构含有28.31% α-螺旋，4.78%β-转角，61.03%无规卷曲，5.88%延伸链；与火炬松、白云杉中的R2R3-MYB蛋白亲缘关系较近；GbR2R3-MYB1基因对盐、干旱、低温及高温胁迫均有响应。