番茄青枯病发生对土壤真菌群落多样性的影响

李婷婷 邓旭辉 李若尘 刘红军 沈宗专 李荣 沈其荣

（江苏省固体有机废弃物资源化高技术研究重点实验室 江苏省有机固体废弃物资源化协同创新中心 作物免疫学重点实验室 南京农业大学资源与环境科学学院，南京 210095）

植物和土壤微生物之间的相互作用关系以及地上与地下所发生的反馈作用在控制生态系统过程和特性方面极其重要［1］。土壤微生物不仅可在元素循环、有机物分解和保持土壤肥力方面发挥关键作用［2］，还在促进植物健康生长方面有着重要影响［3-4］。土壤微生物区系是指微生物生物量、群落、多样性等，它们对维持土壤健康和疾病抑制至关重要［5-6］。在现代农业系统中，高强度集约化或连续种植导致微生物群落多样性减少、区系失衡、土壤有害微生物增殖，最终造成土传病害的大规模爆发［7-9］。其中，设施蔬菜最为典型，如番茄连作后土壤微生物活性降低、土著有益微生物减少、病原微生物积累，最终导致连作障碍严重发生［10-13］。

青枯病是植物中最具破坏性的细菌性疾病之一，青枯菌（Ralstonia solanacearum）有广泛的分布和宿主范围，它入侵不同植物宿主的根部，并定殖木质部血管，导致严重的枯萎病，称为青枯病［14-16］。过去大量的研究聚焦于土壤微生物组，如细菌［17］、真菌［18］、噬菌体［19］、原生动物［20］，乃至土壤线虫［21］等对番茄青枯菌存活及青枯病发生的影响。与此同时，近年来的研究证实，青枯病的发生对土壤微生物与作物内生菌群的装配有着较大的影响，如有研究发现［22］，罹患青枯病植株土壤微生物明显不同于未患病植株土壤，其青枯菌丰度更高、多样性下降、土著有益菌群种类与相对丰度双低；还有研究［23］发现，青枯病发生时番茄根际与内生菌群组成与相互作用关系发生了较大变化，有益细菌种群与抵御青枯菌的侵染密切相关。然而，番茄青枯病发生后对土壤真菌群落影响的研究仍相对较少。

土壤有益真菌能够帮助植物获取营养以促进植物生长和健康［24］。而且土壤真菌能够提高植物对土传病原菌的抗性［25］。然而，土壤中细菌与真菌并不独立存在，两者之间常常相互作用，其相互作用关系对于土壤微生物生态系统功能的形成与维持十分重要［26］。如长期连作使得细菌与真菌互作网络关系趋于简单，且互作网络逐渐转变为真菌占主导地位［27］。真菌性病害如枯萎病的发生对土壤细菌群落的组成与多样性有着重要影响［28］。健康土壤和青枯菌感染的土壤之间的土壤细菌群落组成与多样性有差异［29］，但细菌性病害发生时其对土壤真菌群落的影响仍有待进一步研究。因此，本研究拟采集设施大棚内长期连作番茄田块中罹患青枯病与未患青枯病的植株根围附近的土体及根际土壤，利用荧光定量PCR和MiSeq高通量测序技术比较设施大棚内患病与未患病番茄的土体及根际土壤中真菌群落丰度与组成的差异，为阐明番茄连作土壤微生物区系的调控提供理论依据和方向支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

试验地点位于江苏省南京是蔬菜花卉科学研究所（31°43′N，118°46′E），属于亚热带季风气候，年均温度为15.4℃。供试土壤类型为黄岗土，土壤基本理化性质如下：pH 6.33、有机质23.56 g/kg、全氮1.89 g/kg、有效磷138 mg/kg、速效钾464 mg/kg。

1.2 方法

1.2.1 试验设计 本试验于2015年2至6月在此设施大棚开展，此前已连续种植多季番茄，田块已开始爆发土传青枯病。试验设置4个小区，每个小区面积10 m2。在种植番茄之前，施用7 kg鸡粪有机肥（N+ P2O5+ K2O ＞ 5%）和0.5 kg复合肥（N-P2O5-K2O，15-15-15）作为基肥。施肥一周后，每个小区按照0.6 m × 0.6 m（株距×行距）的密度移栽番茄苗，每个小区约移栽32株。番茄生长期间视长势追施尿素及氯化钾，按照“少量多次”的原则使用滴灌设施进行水分管理。

1.2.2 土壤样品采集 于番茄收获期从每个小区随机选取5株患病或者未患病的植株，用铁铲将距番茄茎部10 cm 以内表层土壤和根系一起挖取，将5株样品混匀后运回实验室内处理。轻抖根系，将附着根上的土壤抖落，连同土体土壤利用四分法保留约200 g土壤作为罹病番茄土体土壤（BD）和健康番茄土体土壤（BH）样品，一份储存在-80℃冰箱内用于后续的测序分析，一份在室温下风干用于土壤理化的测定。将去除轻松附着土壤的番茄根系置入装有150 mL无菌水的250 mL组培瓶，室温下170 r/min振荡30 min，振荡后4 000 × g 离心 5 min，离心后沉淀即为根际土壤，将收集到的根际土壤混匀保存于-80℃备用，作为罹病番茄根际土壤（RD）和健康番茄根际土壤（RH）。

1.2.3 土壤DNA提取和真菌丰度的测定 采用土壤DNA提取试剂盒（DNeasy PowerSoil Pro Kit）按说明书提取并用核酸定量仪（NanoDrop 2000，USA）测定提取的土壤DNA核酸浓度。利用实时荧光定量PCR方法测定土壤样品中总真菌的丰度［30］。扩增引物为 ITS（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和 5.8S（5′-CGCTGCGTTCTTCATCG-3′）。将含酿酒酵母 18S全长的质粒进行梯度稀释，采用ABI 7500荧光定量PCR仪，按照标准程序制成标准曲线。所有样品进行3次重复，用ddH2O代替DNA模板设置为阴性对照。根据各样品Ct值计算每克干土所含的拷贝数，取对数值，以log（copies/g dry soil）表示。

1.2.4 测序文库构建与下机数据处理 参照Kozich等［31］发表的方法构建真菌测序文库。真菌ITS扩增采用引物 ITS1F（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′） 和 ITS2（5′-GCTGCGTTCTTCATCG ATGC-3′）。所有PCR扩增、文库准备及上机测序均在上海派森诺生物科技股份有限公司完成。利用QIIME软件对下机后的原始序列根据相应的barcode信息进行各样品序列分配并去除接头和引物序列。去除低质量序列后，参照Edgar［32］发表的方法，利用Usearch 11.0软件对正反向序列进行拼接，生成操作分类单元（OTU）并挑选出各OTU代表性序列。利用RDP 11.4 classifier［33］将代表性序列与UNITE Fungal ITS trainset数据库比对获取各OTU分类组成信息。最后，对去除所有样品中相对丰度均小于0.01%的OTU的数据进行后续多样性分析。

1.2.5 数据统计分析 样品抽平在R语言内后，基于97%相似度水平计算真菌群落丰富度Chao1指数及多样性Shannon指数。基于Bray-Curtis参数计算各样品主坐标分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）比较罹病与健康番茄土体和根际土壤中真菌群落结构差异。利用R中“vegan”包分析比较土壤类型与患病与否对真菌群落组成的影响。统计分析在 IBM SPSS 20.0（SPSS Inc.，Chicago，USA）中完成，采用单因素方差分析、多重比较及独立样本t检验分析比较处理间的显著性差异。单因素方差分析（ANOVA）假定方差齐性用LSD法，评估各处理之间的潜在差异（P ＜ 0.05）。

1.2.6 数据上传 高通量测序的原始数据已上传至NCBI数据库，编号为PRJNA787090。

2 结果

2.1 罹病与健康番茄植株土壤中真菌的丰度

实时荧光定量PCR的结果表明（图1），在番茄根际土壤中的真菌的丰度显著高于土体土壤（P ＜0.001），而无论是土体和根际，罹病番茄土壤的真菌数量均显著低于健康番茄土壤（P ＜ 0.01）。

图1 罹病与健康番茄土体及根际土壤真菌丰度Fig.1 Fungal abundance in bulk and rhizosphere soils cropped with diseased and non-diseased tomato

2.2 罹病与健康番茄植株土壤中真菌群落的alpha多样性

如图2所示，无论是罹病还是健康番茄土壤中，土体土壤的Chao1指数与Shannon指数均显著高于根际土壤（P ＜ 0.01）。在土体土壤中，罹病番茄土壤的Chao1指数显著低于而Shannon指数显著高于健康番茄土壤（P ＜ 0.05）；而在根际土壤中，罹病番茄土壤Chao1指数和Shannon指数均显著低于健康番茄土壤（P ＜ 0.05）。

图2 罹病与健康番茄土体及根际土壤真菌群落多样性指数Fig.2 Diversity index for fungal communities in the bulk and rhizosphere soils cropped with diseased and nondiseased tomato

2.3 罹病与健康番茄植株土壤中真菌群落的beta多样性

如图3所示，基于Bray-Curtis距离的罹病番茄和健康番茄土体、根际土壤真菌群落PCoA分析结果表明：罹病处理和健康处理番茄根际土壤在主坐标成分一（PCoA1）上明显区分与土体土壤；罹病处理和健康处理在主坐标成分二（PCoA2）上明显区分。进一步的PerMANOVA分析表明，土壤部位（土体和根际）以及番茄患病与否（罹病和健康）都是真菌群落差异的显著性驱动因素（Adonis 检验，土体vs根际F = 8.17，土体vs根际P = 0.002；罹病vs健康F = 5.21，罹病vs健康P = 0.004）。

图3 罹病与健康番茄土体及根际土壤真菌群落主成分图Fig.3 Principal coordinate analysis（PCoA）for fungal communities in the bulk and rhizosphere soils cropped with diseased and non-diseased tomato

2.4 健康与发病番茄土壤真菌群落组成分析

由图4可知，患病与未患病番茄土壤在目水平上组成相似，肉座菌目（Hypocreales）、粪壳菌目（Sordariales）以及被孢霉目（Mortierellales）是各处理相对丰度较高的优势目，但处理间不同目的相对丰度存在一定的差异。在患病土体土壤中，被孢霉目、煤炱目（Capnodiales）的相对丰度显著高于未患病土壤；在患病根际土壤中，煤炱目的相对丰度显著高于未患病土壤（P ＜ 0.05）。

图4 罹病与健康番茄土体及根际土壤真菌优势目的堆积图（a）和差异分析（b）Fig.4 Relative abundances of dominated orders for fungal communities in the bulk（a）and rhizosphere soils crop-ped with diseased and non-diseased tomato（b）

由图5-a可知，在属水平上，在土体土壤中共有295个属，其中225个在罹病与健康番茄土体土壤中共存，健康土体特有的属有13个；而在根际土壤中共有279个属，其中201个在罹病与健康番茄根际土壤中共存，健康根际特有的属有15个。无论是根际土壤还是土体土壤，与健康处理相比，罹病处理其土壤中尖刀镰孢菌属、链格孢属（Alternaria）及Davidiella的相对丰度显著增加（P ＜ 0.05）。此外，健康番茄根际土壤中木霉属、顶孢霉属、粘鞭霉属的相对丰度显著高于罹病番茄根际土壤（图5-b）。

图5 罹病与健康番茄土体及根际土壤真菌组成维恩图（a）与部分优势属的相对丰度热图（b）Fig.5 Venn plot of fungal composition (a) and relative abundances heatmap (b) of partial dominated genera for fungal communities in the bulk and rhizosphere soils cropped with diseased and non-diseased tomato

如图6所示，在OTU水平上，罹病与健康番茄根际土壤间组成差异较土体土壤更明显，土体土壤中仅有3个OTU存在显著差异，而根际土壤中有17个OTU存在显著差异。与健康番茄根际土壤相比，罹患青枯病的番茄根际土壤中Pulchromyces OTU147、镰孢菌属OTU253、曲霉属OTU317的相对丰度显著增加，而粘鞭霉属OTU84与OTU58、顶孢霉属OTU209与OTU210以及被孢霉属OTU381显著减少（图6）。

图6 罹病与健康番茄土体（a）及根际土壤真菌OTU火山图（b）Fig.6 Volcano plot of fungal OTUs in the bulk（a）and rhizosphere soils（b）cropped with diseased and non-diseased soils tomato

3 讨论

根际是一个独特的环境，在根际中病原体和有益微生物都会改变植物的生长和健康［34］。根际真菌群落能够影响作物获取养分以及作物对病原菌入侵的敏感性［35］。本研究利用高通量测序技术分析比较了连作番茄田块中罹患青枯病以及健康番茄土壤的土体及根际真菌组成差异，深入揭示了土传青枯病发生后土壤真菌群落多样性与组成的特征。

病原菌的入侵能够降低土壤微生物多样性［36］，本研究也发现健康番茄土壤的多样性高于罹病番茄土壤的多样性，可能是因为在罹病番茄土壤中青枯菌的丰度增加，占据了更多的生态位，抑制了其它真菌的生存，导致了真菌多样性降低。我们还发现罹病番茄土壤和健康番茄土壤中的真菌群落有着明显的区别。

肉座菌目、粪壳菌目以及被孢霉目等是各处理的优势目，这和李玉娇等［37］的研究一致。肉座菌是一种土壤和叶面昆虫病原真菌［38］，能够控制番茄中的害虫。本研究发现肉座菌目和粪壳菌目在健康番茄根际土壤的相对丰度高于罹病番茄根际土壤，而有研究表明粪壳菌目的相对丰度与发病率呈负相关［39］，可能是健康番茄土壤中肉座菌和粪壳菌的增加，减少了番茄中的害虫，降低了发病率。

本研究发现青枯病发生后显著降低了根际土壤中土著有益真菌粘鞭霉属、被孢霉属、顶孢霉属和木霉属的相对丰度，表明这些种群可能与土壤抑病能力有关。Zhang等［40］的研究报道了粘鞭霉属具有促进植物生长的能力。被孢霉属在有机农业和矿质土壤中有促进作物生长中的作用［41］，而且能够抑制番茄枯萎病的发生［42］。有报道指出顶孢霉属有利于生物修复［43］。木霉能够产生降解病原真菌细胞壁的各种酶，如纤维素酶［44］，而且能够产生一些次级代谢物，促进植物生长和植物防御，如harzianolide［45］和肽类［46］。木霉能够在不同的条件下生存、繁殖能力高，能够改造根际、对植物病原菌有很强的攻击性以及能够促进植物生长［47］。

由尖孢镰刀菌引起的枯萎病是一种典型的真菌土传病害［48］。番茄通常患有由尖孢镰刀菌［49］引起的枯萎病以及由青枯菌［50］引起的青枯病。研究发现番茄连作能够导致青枯菌和尖孢镰刀菌的丰度增加［51］。与王庆华等［52］研究结果相一致，本研究也发现在青枯病发生的番茄土壤中镰刀菌属的相对丰度显著高于未患病番茄。赖朝圆等［53］研究表明，Pulchromyces与香蕉尖刀镰孢菌正相关，与之类似，本研究发现罹病番茄土壤中Pulchromyces和镰刀菌属的相对丰度较健康番茄土壤中均显著增加。

真菌和细菌同时存在于土壤环境中，真菌病害和细菌病害通常同时发生［26，54］。有研究表明土壤同时存在尖孢镰刀菌和青枯菌，而且番茄枯萎病可能是由两种病原菌引起，土壤细菌群落抑制两种病原菌来控制枯萎病发生［55］。本研究也表明在青枯病害发生后的土壤中存在尖孢镰刀菌。目前，我们的研究大多数都是在单一病原菌上，减少病原菌的方法大多是通过直接减少致病菌或者是调控土壤中微生物群落间接减少土传病原菌［56］，但是抑制细菌和真菌病原菌的机制不同，能够抑制细菌病原菌不一定能够抑制真菌病原菌，相反能够抑制真菌病原菌的不一定能够抑制细菌病原菌，还有可能增加另一种病原菌。

微生物、土壤以及植物的互作关系复杂，病原菌入侵能够影响植物地下部微生物群落的组成和功能，进而影响地上部植物的健康和生长。我们通过高通量测序技术分析了青枯病发生后土壤中真菌群落的变化，结果表明，相比于健康处理，青枯病发生后土壤真菌群落组成发现明显变化，如多样性降低，潜在土著有益真菌群（粘鞭霉属、被孢霉属、顶孢霉属和木霉属等）相对丰度显著降低，而有害真菌镰刀菌属的相对丰度显著增加。青枯病发生后真菌群落的演替规律、真菌与细菌的跨界互作关系变化将是未来研究的热点与难点。

4 结论

青枯病的发生改变了番茄土体与根际土壤的真菌群落组成，患病番茄土壤真菌丰度、多样性及土著有益真菌数量降低，而有害真菌数量增加。土壤中同时存在尖孢镰刀菌和青枯菌，番茄枯萎病可能是由两种病原菌引起，之后的研究要关注减少两种病原菌。