高寒地区根瘤菌拌种对禾/豆混播土壤微生物群落的影响

颜珲璘 芦光新 邓晔 顾松松 颜程良 马坤 赵阳安 张海娟王英成 周学丽 窦声云

（1.青海大学农牧学院，西宁 810016；2.中国科学院生态环境研究中心 中国科学院环境生物技术重点实验室，北京 100085；3.青海省草原改良试验站，海南州 813000）

近年来，由于人类活动和全球气候变化等多因素影响，青藏高原高寒草地出现明显的退化，使得牧草产量供不应求，严重影响了人们的生产生活，且对青藏高原生态系统的生态功能造成了威胁［1］。长期施用化肥不仅抑制牧草的生长，还破坏了土壤环境，为土地的可持续发展埋下隐患。这一问题目前已经受到研究者们的广泛关注。禾/豆混播是人工草地种植最常见的方式之一，具有提升产量、实现农业生产和环境双赢的效应［2］。它可以通过改善草地生态系统氮元素的平衡利用、改善土壤肥力来提高草地的产量和品质［3］，在促进化肥减施增效、助力农业绿色发展上有重要的意义。

中国青海省青海湖西岸的铁卜加草原改良站（99°35′E，37°05′N），海拔 3 270 m，年平均气温-0.7℃。最热月（7月）平均气温17.5℃，最冷月（1月）平均气温-22.6℃，年降水量为1 495.3 mm。主要种植植物类群是环湖寒生羊茅（Festuca kryloviana Reverd）、青海草地早熟禾（Poa pratensis L.cv.Qinghai）、扁穗冰草（Agropyron cristat（L.）Gaertn）等。该地区属于高原干旱大陆性气候，具有青藏高原高寒草地生态环境的典型性、代表性特征。为了减少此地区肥料的使用，为牛羊供给足够的牧草饲料，本试验采用拌根瘤菌剂的方法使禾/豆混播的这种效应得到更大的提升。根瘤菌作为常用拌种剂，是由根瘤菌生产菌制成的微生物制剂。大量的活体根瘤菌可以有效增加根部根瘤的数量，供应牧草生长所需的氮素，进而减少肥料的使用，节省生产成本［4-5］。

微生物作为土壤的活跃组成成分，其组成和生命活动与土壤地理化学性质及土壤营养物质循环息息相关。土壤微生物可以分解有机质，通过将肥料以及落叶残根内有机质分解成游离态营养物质以供植物吸收利用，促进植物生长发育［6-8］。而根际微生物与植株根部营养具有密切的关系，与植株共生的根瘤菌、菌根真菌都能为其提供氮元素、磷素以及有机质、维生素等营养。因此，根际微生物对促进植株生长有重要意义［9］。拌根瘤菌会对土壤微生物的多样性以及群落结构产生显著的影响，研究拌种对根周与根际微生物多样性和群落结构以及对牧草生长促进作用很有必要［10］。

高通量测序（high-throughput sequencing）已成为研究环境微生物多样性和群落结构的重要方式［11-13］。本文采用高通量测序技术分析根瘤菌拌种在禾/豆混播方式下的土壤微生物多样性和群落结构，了解拌根瘤菌后对土壤微生物组分的具体影响，将不同处理对土壤微生物功能的变化进行FAPROTAX预测，以及BugBase分析，比较不同处理下土壤微生物高水平表型的分类和变化，从而为拌根瘤菌对牧草生长的促进作用提供土壤微生物方面的科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

样地以‘阿坝’垂穗披碱草（Elynus nutans Griseb.cv.‘Aba’）和‘川草2号’老芒麦（Elymus sibiricus L.cv.‘Chuancao No.2’）与苜蓿‘北林 201’（Medicago sativa cv.‘Beilin201’）分别以 1∶1比例在2020年6月进行播种，将苜蓿种子进行苜蓿根瘤菌菌液（上海瑞楚生物科技有限公司，乳白色，活菌群落：1010CFU/mL）拌种，以条播形式混播。即‘阿坝’垂穗披碱草+苜蓿、‘阿坝’垂穗披碱草+苜蓿（拌根瘤菌）、‘川草2号’老芒麦+苜蓿、‘川草2号’老芒麦+苜蓿（拌根瘤菌）4种混播组合，每个处理重复3次，共12个小区（表1）。

表1 试验设计Table 1 Experimental design

1.2 方法

1.2.1 土壤理化性质及牧草地上生物量测定 将所有采集土样参照《土壤农业分析学分析方法》进行测定。在牧草生长期，采用五点法每隔10 d对株高进行测量。随机选择各小区10株牧草进行刈割，剪取地上部分，作为地上生物量指标。所有数据采用SPSS 25.0进行单因素方差分析（One-Way ANOVA）。图表中数据为平均值±标准差（x±SD）。

1.2.2 土样采集及处理 由于进入霜冻的气象因素以及牧草进入枯草期之前要完成采样，土壤样品于2020年9月采集，在12个小区中，根据草地样方采集的随机取样方式挖出完整的根系，采取“抖根法”抖落植株根系周围的土壤作为根周土壤。根周土壤不区分禾本科与豆科，拌根瘤菌（B）、不拌根瘤菌（N）；然后用刷子在PBS（0.1% Tween 80）中收集黏附根际土壤样品，共12个土样。搅拌5 min后，将得到的悬浮液倒入无菌离心管中，重复此过程2次。将悬浮液混合并离心，在提取DNA之前，将所得沉淀物颗粒储存在-80℃。根际土区分禾本科与豆科，由测序分析结果发现，两种禾本科牧草的土壤微生物没有显著差异（P＞0.05），因此将两种禾本科牧草放在一起分析。根际土壤：禾本科拌种（HB：A1+A2），禾本科不拌种（HN：D1+D2），豆科拌种（DB：A1+A2），豆科不拌种（DN：D1+D2）。由于混播牧草长势不均匀，导致根际土壤缺少4个样本，共有32个土样。

1.2.3 DNA测序 土壤DNA提取、PCR扩增以及测序采用土壤DNA提取试剂盒（MOBIO Laboratories，Carlsbad，CA，美国）操作方法对所有32个土壤样本进行DNA的提取。所有样品浓度和纯度使用Nanodrop2000进行检测，浓度均在20 ng/μL以上，A260/A280为1.8-2.0，说明土壤样本DNA浓度及纯度较好，可进行PCR实验。

对32个土壤样本进行16S rRNA的基因扩增，上游引物为515F：5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′；下 游 引 物 为 806R ：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′；引物序列包含简并碱基，M：C或A，H：A、C、T，V：A、C、G，W：A或T。用带有10 bp长的barcode序列的特异引物以50 μL 体系进行PCR扩增，体系包括 25 μL的 2×Phanta Max Buffer，1 μL 的 DNTP Mix（0 mmol/L each），2 μL 的上游引物和下游引物，1 μL的Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase，1 μL的 DNA 模板，ddH2O 加至 50 μL。PCR反应条件：95℃预变性3 min，95℃变性20 s，55℃退火25 s，72℃衍生45 s，共32个循环，最后72℃彻底延伸5 min。根据不同样本标签，将32个土壤样本回收后的DNA定量到20 ng/μL以上，采用KAPA HyperPrep Kit DNA文库构建试剂盒制备测序文库。在Illumina Miseq平台进行测序。

序列预处理和生物信息学方法。将所有原始数据以FASTQ格式以及样本对应的Barcode信息上传到Galaxy分析平台上（http://mem.rcees.ac.cn：8080）进行分析［14］。使用Trim Primer将正反向引物去除。通过FLASH将正反向序列进行拼接［15］。使用Btrim［16］步骤去除由FLASH拼接后序列中的低质量区域。使用Trim N去除小于150 bp的序列以及模糊碱基（N）。通过Trim by sequence length对序列进行筛选和修剪，保留长度在245-260 bp的目的序列。序列通过UPARSE方法按97%相似度进行OTU归类，生成原始OTU表，并对原始表进行重抽，使每个样品序列数相同，用重抽后OTU进行后期统计分析［17-18］，并使用 FAPROTAX［19］进行功能预测，根据其分类丰度，使用软件包“heatmap package”绘制功能热图。同时使用BugBase［20］对不同处理的土壤微生物高水平表型的分类和变化进行分析。

1.2.4 qPCR实验方法 针对nifH基因核酸序列设计扩增nifH基因的引物对，上游引物nifHF：5′-TACGGNAARGGSGGNATCGGCAA-3′， 下 游 引 物Cy55Nh428R ：5′-CCRCCRCANACMACGTC-3′，由上海生工生物工程有限公司合成。取10 μL质粒稀释10倍作为模板，设置 2.0×109copies/μL-2.0×103copies/μL每个梯度各设3个平行进行重复试验，建立标准曲线并检验方法灵敏度。反应采用20 μL体系：模板 1 μL，上下游引物各 0.4 μL，10 μL 2×Phanta Max Buffer，8.2 μL ddH2O。PCR 反应条件 ：95℃预变性30 s；95℃变性10 s，60℃退火25 s，72℃延伸45 s，39个循环；荧光信号采集设在72℃。反应结束后，设55-95℃的溶解曲线，温度以0.5℃/5 s递增。统计方法用CFX96TM实时PCR检测仪进行ΔCt分析，计算每组基因拷贝数均数±标准差值（x±SD），各进行3个平行。

1.2.5 生态分析 通过RDP分类数据库对OTU进行注释。计算样本间的Bary Curtis距离，再进行非度量多维尺度NMDS（non-metric multidimensional scaling）分析，为了验证根周与根际土壤微生物群落之间群落结构是否有显著差异，通过相似性分析（ANOSIM）、多响应置换过程分析（MRPP）以及置换多元方差分析（PERMANOVA）3种方法进行了不相似性检验（dissimilarity test）。

2 结果

2.1 土壤理化性质及牧草地上生物量分析

如表2所示，拌根瘤菌对土壤养分产生了不同的影响。与不拌种相比，根瘤菌拌种对土壤硝态氮、有机碳均有所增加，但无显著差异（P＞0.05）。此外，对牧草植株生长曲线和植株鲜重进行了测量分析，如图1-a所示，发现通过拌种后，对禾本科牧草（‘阿坝’垂穗披碱草、‘川草2号’老芒麦）影响并不显著。而苜蓿经过拌种后，株高高于不拌种，但效果也不显著（P＞0.05）。根瘤菌拌种后，豆科植物的鲜重增加，与不拌种相比，无显著差异（图1-b）。由以上结果可知，根瘤菌拌种改变了土壤理化性质以及苗期的牧草生长情况。

图1 牧草地上生物量Fig.1 Biomass on pasture

表2 土壤理化性质Table 2 Soil physical and chemical properties

2.2 根周和根际土壤原核微生物群落多样性分析

通过高通量测序分析，从32个样本中共获得4 624 690个有效序列，并从这些序列中识别出8 814个OTU。图2-a稀释曲线所示，OTU数随着序列数的增加达到平台期，说明测序深度已基本满足下游分析。由图2-b维恩图，对32个土壤样品的共有和独有OTU行了可视化，结果显示根周土壤与根际土壤共有2 328个OTU，占全部OTU的26.4%；根周不拌种土壤（N）拥有最多的独有OTU（551个），占全部OTU的6.2%；根周拌种（B）独有542个OTU，占全部OTU的6.1%；根际豆科拌种（DB）独有的OTU数最少为103个，占0.1%。根际豆科不拌种（DN）独有224个OTU，占全部OTU的2.5%；根际禾本科拌种（HB）独有326个OTU，占全部OTU的3.7%；根际禾本科不拌种（HN）独有172个，占全部OTUs的2.0%（图2）。这些结果说明，拌种减少了根周土壤原核生物群落物种数以及豆科根际土壤原核生物群落的物种数。

图2 土壤原核生物微生物群落稀释曲线和共有和独有OTUs 的韦恩Fig.2 Rarefaction curves for soil prokaryotic microbial communities and Venn diagram showing the unique and shared OTUs

如图3-a-c所示，对所有土壤样本的原核微生物α多样性指数进行分析，Shannon、Observed_richness、Inverse Simpson指数结果表明，拌种处理后，α多样性在根周和根际中，均显著（P＜0.05）低于不拌种。使用Chao值对所有根周和根际土壤原核微生物群落的物种进行估计，图3-d表明，DB处理的Chao值最低（P＜0.05）。根周土壤B和N比较，拌根瘤菌处理的Chao显著低于不拌种，推测拌根瘤菌会减少原核生物的繁殖。根际土壤中，拌种处理的Chao显著低于不拌种，说明拌根瘤菌减少了根际土壤原核微生物多样性。

图3 α多样性分析Fig.3 α diversity analysis

2.3 根周和根际土壤原核微生物群落物种组成

在门水平分类上，如图4-a所示，将OTU分为36门。根周和根际土壤细菌群落核心菌门（＞1%）分别是放线菌门（Actinobacteria，26.11%-46.20%）、变形菌门（Proteobacteria，20.61%-32.91%）、酸杆菌门（Acidobaeteria5，0.64%-8.15%）、厚壁菌门（Firmicutes，1.74%-9.51%）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes，3.58%-6.21%）、拟杆菌门（Bacteroidetes，3.01%-4.96%）、浮霉菌门（Planctomycetes，1.57%-4.97%）、绿弯菌门（Chloroflexi，1.18%-3.66%）、奇古菌门（Thaumarchaeota，1.02%-4.56%）。在根周土壤原核微生物群落中，拌种（B：27.11%）处理的放线菌门高于不拌种（N：26.55%）的相对丰度，根际土壤微生物群落呈相同规律，HB、HN、DB、DN的相对丰度分别是41.26%、39.45%、46.20%、39.02%，表明拌种显著增加土壤放线菌的相对丰度。

对根周与根际土壤原核微生物进一步在属水平上进行群落组成成分的变化，不同处理经高通量测序共得577属。结果（图4-b）表明，在属水平上具有丰富的多样性，假杆菌属（Pseudarthrobacter，0.38%-20.28%）、芽球菌属（Blastococcus，5.57%-13.65%）、微小杆菌属（Exiguobacterium，0.07%-8.59%）、芽孢杆菌属（Gemmatimonas，2.13%-5.45%）、Gp6（2.70%-3.20%）、亚硝化球菌属（Nitrososphaera，1.02%-4.56%）、嗜 酸 硫杆 菌 属（Aciditerrimonas，0.21%-3.69%）、泛菌属（Pantoea，0.73%-4.40%）、Gaiella（1.29%-3.05%）、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas，1.45%-2.57%）、不动杆菌属（Acinetobacter，0.52%-2.99%）为优势属，在不同的处理中相对丰度有所不同。在根瘤菌拌种后的处理中，假杆菌属（Pseudarthrobacter）无论在根际还是根周土壤，其相对丰度在拌种后均显著增加（P ＜ 0.05）。在根周土壤B和N中，相对丰度为1.28%、0.38%，在根际土壤DB、DN、HB、HN中，相对丰度分别是20.28%、13.21%、12.16%、8.19%。芽孢杆菌属（Gemmatimonas）在根周和根际土壤原核微生物中，拌根瘤菌后的处理B（2.22%）、HB（3.21%）、HN（5.45%）都有所增加，且豆科根际的芽孢杆菌数量显著增加，不拌根瘤菌的N、HN、DN芽孢杆菌分别是2.10%、2.98%、3.36%。同时亚硝化球菌属（Nitrososphaera）也在拌根瘤菌处理后的土壤中增加，在根周B、N分别是1.38%、1.28%，在根际土壤HB、HN、DB、DN分别是2.43%、1.02%、4.56%、4.05%。嗜酸硫杆菌（Aciditerrimonas）其相对丰度在拌根瘤菌后也显著升高。在根周土壤B、N中，相对丰度为0.38%、0.21%，在根际土壤DB、DN、HB、HN中，相对丰度分别是3.69%、2.88%、3.50%、2.00%（P＜0.05）。

图4 土壤原核生物群落丰度比例Fig.4 Percentage of soil prokaryotic microbial community abundance

2.4 根周与根际土壤原核微生物群落结构

为了研究根周和根际土壤原核微生物群落的β-多样性，基于Bary-Curtis距离，通过非度量多维尺度分析（non-metric multidimensional scaling，NMDS）对根周和根际土壤原核微生物群落进行分析，并进行不相似检验（dissimilarity test）分析验证。如图5和表3所示，根周土壤B、N和根际土壤HB、HN、DB、DN之间的细菌群落之间的Bary-Curtis距离具有明显的空间分布，存在显著差异。根周土壤与根际土壤，不管是禾本科根际还是豆科根际在图中的距离都较远，说明根周土壤与根际土壤原核生物群落差异较大。从Bary-Curtis距离矩阵的不相似检验结果看，B和N具有显著差异（P＜0.05），HB和HN也具有显著差异（P＜0.05），表明拌种处理对根周和根际禾本科土壤原核生物群落β-多样性（Bary-Curtis距离）都有影响。

表3 基于原核微生物群落Bary-Curtis距离的不相似检验Table 3 Dissimilarity test based on Bary-Curtis distance of soil prokaryotic communities

图5 根周与根际原核微生物群落结构非度量多维尺度分析（NMDS）Fig.5 NMDS of bulk and rhizosphere soil prokaryotic community structure

2.5 功能预测

FAPROTAX是适合分析环境样本的化学循环过程，尤其是氮、磷、碳等元素进行功能注释的预测。为了研究不同处理根周与根际土壤原核微生物关于固氮的功能，采用FAPROTAX进行了细菌的功能预测。通过功能预测，共得出55种生态功能类群，根瘤菌的主要作用是通过与苜蓿根瘤共生而固氮，进而促进牧草的生长，因此本试验挑选了关于氮循环的13种生态功能，分别是好氧氨氧化（aerobic_ammonia_oxidation）、亚硝酸盐氧化（aerobic_nitrite_oxidation）、硝化作用（nitrification）、厌氧氨氧化（anammox）、硝酸盐反硝化（nitrate_denitrification）、亚硝酸盐反硝化（nitrite_denitrification）、氧化亚氮反硝化（nitrous_oxide_denitrification）、反硝化（denitrification）、固氮（nitrogen_fixation）、亚硝酸盐呼吸（nitrite_respiration）、硝酸盐呼吸（nitrate_respiration）、硝酸盐还原（nitrate_reduction）、氮气呼吸（nitrogen_respiration）。根据功能注释相对丰度，绘制功能多样性热图，如图6所示，在根周土壤B（10.9%）和N（9.9%）中，硝化作用丰度最高。根际土壤中，硝酸盐还原作用丰度最高，分别是HB（7.8%）、HN（4.5%）、DB（13.8%）和DN（11.3%）。根周与根际土壤最低为反硝化作用种群。拌种与不拌种相比，拌种处理下硝酸盐还原作用（nitrate_reduction）的丰度显著提高了1.5%-3.3%（P＜0.05）。

图6 不同处理根周和根际土壤原核微生物功能多样性热图Fig.6 Heat map of prokaryotic functional diversity in bulk and rhizosphere soil under different treatments

BugBase是用于微生物数据进行高水平表型（high-level phenotypes）的分类工具。根瘤菌是需氧型的革兰氏阴性菌，为了探究拌根瘤菌后，其对根周和根际土壤原核微生物的影响，通过BugBase对不同处理样品中微生物的表型进行了预测。如表4所示，根周土壤中，拌种与不拌种相比，拌种后需氧、厌氧、革兰氏阳性菌的个数减少，分别是99、48、39，不拌种处理的需氧、厌氧、革兰氏阳性菌的个数分别是117、50、48。拌种处理后，兼性厌氧、革兰氏阴性增加，分别是25、233，不拌种的兼性厌氧、革兰氏阴性菌的个数是18、232。根际土壤原核微生物，禾本科拌种（HB）的需氧、厌氧、革兰氏阳性、兼性厌氧、革兰氏阴性菌个数都比不拌根瘤菌（HN）的个数多，分别是51、30、14、116、21，而不拌根瘤菌的个数分别是19、24、9、84、15。豆科根际拌根瘤菌后，DB处理组需氧、厌氧、革兰氏阳性、兼性厌氧、革兰氏阴性都比不拌根瘤菌的DN处理少，菌的个数分别是13、13、3、39、6，DN中菌的个数分别是36、30、10、103、14。以上结果说明，拌根瘤菌对禾本科和豆科牧草土壤原核微生物群落的响应不同。

表4 微生物表型预测结果Table 4 Bugbase results

2.6 qPCR定量分析

（2.0×109-2.0×103）copies/μL 7 个梯度，每个梯度3个平行进行重复试验的nifH基因qPCR扩增结果呈指数增长期的曲线平行扩增，基本符合BIORAD公司提供的实时荧光定量PCR国际化标准。本试验对根际土壤原核微生物群落中nifH基因进行了定量分析，如图7所示，在拌种处理后，豆科根际原核微生物的nifH基因显著高于不拌种的丰度，同时禾本科根际原核微生物的nifH基因也呈增长趋势，无显著差异。

图7 不同处理nifH-qPCR定量Fig.7 Different treatments of nifH-qPCR quantification

3 讨论

3.1 拌根瘤菌改变了土壤理化性质及牧草地上生物量

拌根瘤菌会改变土壤理化性质和牧草的生物量，但是改变无显著差异。根瘤菌剂是一种微生物肥料，首先改变微生物群落，经过微生物群落影响土壤和植物，这个过程需要一定的时间。本苜蓿品种首次于青藏高原高寒地区种植，牧草对生长环境也未适应，从而导致牧草的生物量增加不显著，其效果后期还需要继续进行研究。

3.2 拌根瘤菌降低了根周和根际土壤原核微生物群落多样性

在根周土壤中，拌种和不拌种相比，拌种后的α多样性（Chao）显著低于不拌根瘤菌，表明拌根瘤菌后群落物种丰富度发生了变化。对于根际土壤，拌种后的α多样性显著低于不拌种，说明拌根瘤菌对土壤根际原核微生物多样性有显著影响。综上，拌根瘤菌会降低根周和根际原核微生物丰富度。

3.3 拌根瘤菌改变了根周和根际土壤原核微生物群落结构

通过高通量测序分析发现，在拌根瘤菌后根周土壤和根际土壤原核生物群落结构有所不同。在门水平上放线菌门、变形菌门、酸杆菌门相对丰度较高（＞5%），在根周土壤中，变形菌门为优势菌群，在根际土壤中放线菌门为优势菌群。变形菌是细菌中最大的一个门，是革兰氏阴性菌，它在农业、医学、环保等领域具有广泛的应用价值，尤其是在氮的促进利用、防治植物病害、土壤修复中起到重要作用［21］。研究表明高寒地区土壤细菌优势门包括变形菌门、放线菌门、酸杆菌门、疣微菌门、绿弯菌门和厚壁菌门［22-24］，与本研究的结果相同。放线菌门是根际土壤中占比较大的门，属于革兰氏阳性菌，它能够拮抗病原菌，还能产生抗生素，分泌细胞分裂素从而促进作物的生长［25-27］。并且可以分解纤维素、木质素等有机物，促进土壤形成团粒结构，改善土壤品质［28］。拌根瘤菌后，禾本科和豆科的根际土壤原核生物群落中，放线菌的数量有效提高。说明拌根瘤菌后可以提高‘川草2号’老芒麦、‘阿坝’垂穗披碱草、苜蓿‘北林201’的根际氮素利用，还可以提高牧草的抗病性。

进一步对土壤原核微生物的属水平进行研究发现，在不同处理条件下各组的丰度存在差异。在根周土壤中，拌根瘤菌（B）中，芽球菌属、Gp6、泛菌属的丰度较高（＞3%），在不拌根瘤菌（N）中，Gaiella的丰度较大（＞3%），而芽球菌属的丰度显著降低。在根际土壤中，禾本科拌根瘤菌（HB）处理，假杆菌属、芽球菌属的丰度很大（＞10%），与不拌根瘤菌（HN）相比，HN中假杆菌属显著降低了4.01%，芽单胞菌属、亚硝化球菌属、嗜酸硫杆菌属都低于拌根瘤菌的丰度。豆科根际土壤拌根瘤菌（DB）处理，假杆菌属、芽球菌属的丰度较大（＞10%），而与不拌根瘤菌（DN）比较，芽球菌属在DN中显著降低了7.06%。在根周和根际土壤微生物中，芽孢杆菌属在拌根瘤菌后数量有效提高。研究表明芽孢杆菌属可以促进牧草对氮的吸收，有一定的固氮作用，可以有效减少化肥的使用［29］。亚硝化球菌属则是对酸性土壤的硝化作用的重要驱动者，在氮循环中扮演者重要的角色，有效促进了土壤中氮的使用［30-31］。

在拌根瘤菌后，根周和根际土壤的原核微生物群落发生了改变，微生物所处环境也发生了相应改变，其群落结构也产生了区别，拌根瘤菌后，对土壤中有益菌产生了影响。而且氮素循环增强，也引起了群落结构上的区别。从β-多样性结果看出，拌根瘤菌对细菌群落有一定的影响，根周和根际群落差异较大，可能是部位引起的差异或者拌根瘤菌对根周和根际的作用不同。具体原因还需后续试验验证。

3.4 拌根瘤菌对根周和根际土壤原核生物功能的影响

FAPROTAX能对氮、磷、氢元素循环进行功能注释的预测，其预测性准确度较高。FARPOTAX功能预测结果表明，在根周土壤原核微生物中，拌根瘤菌导致了13种有氮循环的功能菌都有所增加，这可能是拌根瘤菌和根周和根际土壤原核微生物群落有益功能菌的数量有增加有关，拌根瘤菌有利于氮循环功能的加强。本研究利用BugBase对根周和根际土壤原核微生物群落表型进行分析，拌根瘤菌处理，不管是在根周土壤还是根际原核微生物群落，需氧、厌氧、兼性厌氧、革兰氏阴性、革兰氏阳性菌的数量都发生了变化，说明拌根瘤菌会引起菌落表型的改变。之前很少有研究利用BugBase对高寒草地环青海湖地区禾/豆混播草地的根周和根际土壤原核生物群落表型进行分析，我们的结果可以为禾/豆混播加根瘤菌拌种栽培方式的理论基础提供一些新的认识。

3.5 拌根瘤菌增加了根际土壤原核微生物nifH的丰度

研 究 结 果 显 示，nifH定量在（1.2×107）-（16.6×107）拷贝/g土之间。拌根瘤菌与不拌种相比，豆科根际的固氮基因丰度显著高于不拌种，说明拌种增加了固氮基因的丰度，它能够改变微生物群落中的相对丰度，进而影响生物固氮，提高牧草生产力。在青海高寒草地禾/豆混播拌根瘤菌nifH基因的定量未见报道，我们的研究认为拌根瘤菌处理是促进牧草生长的有效方法。

4 结论

拌根瘤菌处理改变高寒地区禾/豆混播草地土壤原核微生物的群落结构，降低丰富度和多样性，改变土壤理化性质，提高牧草地上生物量。拌根瘤菌后，根周和根际土壤的变形菌、放线菌、芽孢杆菌属、亚硝化球菌属等有益菌的丰度显著增加。土壤硝态氮都有所上升，且提高了nifH基因的丰度，对微生物-植株-环境的氮循环得到了有效提高。拌根瘤能够促进形成更稳定且提高牧草产量的原核微生物群落结构。