一株高产脂肪酶菌株WCO-9全基因组测序及比较基因组分析

张泽颖 范清锋 邓云峰 韦廷舟 周正富 周建 王劲江世杰

（1.西南科技大学生命科学与工程学院，绵阳 621010；2.中国农业科学院生物技术研究所，北京 100081；3.西南科技大学生物质材料教育部工程研究中心，绵阳 621010）

脂肪酶（lipase，EC3.1.1.3，即甘油三酯水解酶）是催化长链甘油三酯水解为脂肪酸、二酰甘油、单酰甘油的酶类［1］。除水解活性外，脂肪酶还具有酯交换、酯化、氨解和醇解活性，被广泛应用于多个领域［2-6］。研究发现，自然界大约有2%的微生物产脂肪酶，至少包括细菌的28个属，如芽孢杆菌属、假单胞菌属、沙雷氏菌属和不动杆菌属等［7］。产脂肪酶菌株分离筛选、脂肪酶活力测定及脂肪酶基因挖掘一直是国内外的研究热点，黄阳天等［8］利用橄榄油作为唯一碳源从海泥中筛选获得两株具有产脂肪酶能力的海洋细菌，即假单胞菌S11和芽孢杆菌S22，同时这两株产脂肪酶细菌还表现出产电性能；Haq等［9］从石油污染的土壤中分离出产脂肪酶短杆菌SB11 MH715025和假单胞菌SB15 MH715026，所产生的脂肪酶可有效制备生物柴油，产率高达97%。

许多微生物受环境因子驱动进化出一系列适应新环境的特异基因（簇），为进一步从获得的微生物中挖掘特殊功能基因和比较种间/内基因的差异，随着测序技术成本的降低，基于全基因组测序（whole-genome sequencing，WGS）的组学技术已然成为快速、精确、有效的策略［10］。许多研究者采用WGS技术获得物种全基因组序列进而揭示其发挥特殊功能的机制，吕瑞瑞采用PacBio SMRT三代测序技术对Lactobacillus paracasei PC-01进行全基因组测序，通过比较基因组学方法揭示39株L.paracasei菌株之间的差异［11］。Lim等［12］对红树林土壤中分离的Bacillus solimangrovi GH 2-4T菌株进行全基因组测序，明确了与修复基团和色素形成、蛋白质及碳水化合物代谢有关的基因；Patel报道了一株脂肪酶活性较高的印度不动杆菌UBT1菌株，并通过基因组序列探明了菌株所产脂肪酶活性较高的原因是由于三酰甘油脂肪酶、磷脂酶等的特异酶的存在［13］。因此利用全基因组测序技术对于产脂肪酶微生物的功能解析、挖掘特异脂肪酶基因具有重要意义。

不动杆菌是微生物脂肪酶的重要菌株来源，不动杆菌属来源脂肪酶具有良好的温度适应性和底物广谱性，是脂肪酶研究的一个重要方向。本研究将前期筛选获得的一株不动杆菌属高产脂肪酶菌株WCO-9进行全基因组测序与分析，对深入了解脂肪酶产生菌WCO-9的产酶机制及新型脂肪酶特异基因挖掘具有重要意义，为后期高产脂肪酶工程菌的创制及工业化应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

研究所用产脂肪酶菌株WCO-9为本实验室从餐厨废油污染的土壤中分离筛选获得，16S rRNA基因序列鉴定该菌为Acinetobacter junii，并于广东省微生物菌种保藏中心保藏（编号为GDMCC No：61851）。对照菌株Acinetobacter junii ATCC 17908购自中国农业微生物菌种保藏管理中心。LB培养基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，121℃、1.304×105Pa灭菌30 min。细菌基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技公司。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA提取 将WCO-9菌株于LB培养基中30℃培养16 h。取50 mL菌液4 000 r/min、4℃离心10 min，弃上清收集菌体，用无菌水重悬洗菌2次，根据细菌基因组DNA提取试剂盒操作说明提取细菌总DNA，并进行琼脂糖凝胶电泳检测及浓度和纯度测定。提取的样品总DNA干冰保存寄送并委托北京百迈客生物科技有限公司完成测序工作。

1.2.2 菌株WCO-9比较基因组学分析 将WCO-9菌株16S rRNA基因序列经BLAST比对，选取NCBI数据库中同源性较高的10个菌株进行系统发育树分析。使用MEGA6.0软件，采用Neighbor-joining 法和1 000次重复的Bootstrap值构建进化树。使用Mauve软件Mauvealigner算法将WCO-9菌株基因全基因组序列与参考近源菌株ATCC 17908全基因组序列进行共线性分析。设置局部共线区的最小权重值（locally collinear block weight，LCB weight）为 325。

1.2.3 菌株WCO-9的脂肪酶活性测定 取培养至对数中期的WCO-9与ATCC 17908菌液各5 μL点至罗丹明-油脂同化平板圆孔内，于30℃培养4 d后观察透明圈情况，初步判断菌株产脂肪酶的能力。分别以不同链长的对硝基苯酯ρ-NPC10、ρ-NPC14和ρ-NPC18为底物，采用对硝基苯酚法测量WCO-9菌株和对照菌株ATCC 17908粗酶液的脂肪酶活力。1个酶活单位（1U）定义为每分钟释放1 μmoL的对硝基苯酚需要的酶量。分别取菌株WCO-9与ATCC 17908发酵上清液作为粗酶液，参考国标GB/T 23535-2009 《脂肪酶制剂》方法，测定脂肪酶对橄榄油的水解活性。

1.2.4 菌株WCO-9基因组测序与组装 提取的WCO-9样品总DNA经质量验证合格，使用Canu v1.5软件对过滤后reads进行组装，通过Racon v3.4.3软件利用三代reads对组装结果进行矫正，通过Circlator v1.5.5软件进行环化和调整起始位点，采用Pilon v1.22软件利用二代数据进一步进行纠错，得到准确度更高的基因组后进行后续分析。

1.2.5 基因功能注释 使用软件tRNAscan-SE v2.0、Infernal v1.1.3、Genewise v2.2.0、RepeatMasker v4.0.5预测基因组中的tRNA、rRNA、ncRNA、假基因及重复序列。通过Prodigal v2.6.3软件对组装后的基因组进行编码基因预测，将预测得到的基因序列与COG、KEGG、Swiss-Prot、TrEMBL、Nr、GO、Pfam等数据库进行比对，获得基因功能注释结果。

2 结果

2.1 基于16S rRNA基因的系统进化分析

为了获得能够降解油脂的微生物，本研究前期从餐厨废油污染的土壤中通过选择平板筛选获得一批具有产脂肪酶能力的菌株，经16S rRNA基因序列分析，其中产酶能力最强的菌株为不动杆菌属细菌，与ATCC 17908菌株［14］的同源性最高（99.99%），本研究命名为WCO-9。从WCO-9 16S rRNA基因序列构建的系统发育树（图1）可以看出，WCO-9菌株与ATCC 17908的亲缘关系最近，因此选择该菌株作为对照菌株对WCO-9的产脂肪酶能力进一步比较分析。

图1 基于16S rRNA基因序列的系统发育树分析Fig.1 Neighbour-joining phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences

2.2 菌株WCO-9产脂肪酶活性比较分析

通过罗丹明B-油脂同化平板和国标法测定脂肪酶水解活性，分析WCO-9菌株与ATCC 17908对照菌株对底物油脂的降解能力，初步比较其产脂肪酶活力。结果显示，与对照菌株相比，WCO-9菌株能够产生明显较大的降解圈，且其水解底物橄榄油的酶活力为2 833 U/L，是对照菌株ATCC 17908的116倍（表1）。同时，测定WCO-9菌株与对照菌株ATCC 17908对含有不同链长脂肪酸的对硝基苯酯 ρ-NPC10、ρ-NPC14和 ρ-NPC18的水解能力。结果显示，WCO-9菌株所产脂肪酶活性远高于对照菌株ATCC 17908，WCO-9菌株对底物 ρ-NPC10、ρ-NPC14和ρ-NPC18的降解能力分别为对照菌株的2 000倍、10倍和4倍，且对ρ-NPC10的水解能力最强，达到2 400 U/mL，随着脂肪酸链的延长酶活性降低（图2-B）。总体而言，相比于亲缘性较高的ATCC 17908对照菌株，WCO-9菌株对底物油脂具有较强的降解能力。

图2 WCO-9菌株产脂肪酶活性分析Fig.2 Lipase activity analysis of WCO-9 strain

表1 菌株WCO-9所产脂肪酶对底物橄榄油的水解能力分析Table 1 Analysis of the hydrolysis ability of lipase from WCO-9 strain on the substrate olive oil by GB/T 23535-2009 method

2.3 菌株WCO-9基因组组装与全基因组概况

基于WCO-9菌株高产脂肪酶的特异性，为深入挖掘脂肪酶特异编码基因，本研究对WCO-9菌株进行了全基因组测序。基因组序列提交至GenBank数据库，登录号为CP090890。测序结果表明WCO-9基因组大小为3 193 903 bp，基因组圈图如图3所示。通过组装构建，获得1个Contig，1个Scaffold，平均GC含量为38.62%。通过Prodigal v2.6.3软件预测，获得组装后WCO-9菌株的编码基因信息，预测含有2 929个编码基因，总长度达2 796 966 bp，平均长度954 bp。非编码RNA预测结果显示，包含18个rRNA，74个tRNA，48个其它的ncRNA。此外，预测获得1个207 bp的假基因。

图3 菌株WCO-9基因组图谱Fig.3 Genome map of strain WCO-9

2.4 基因功能注释

2.4.1 GO数据库注释 将预测基因与GO数据库进行BLAST比对，获得基因的分类注释信息，包括细胞组分（cellar component，CC）、细胞分子功能（molecular function，MF）和生物过程（biological process，BP）。产脂肪酶菌株WCO-9在GO数据库中的统计结果如图4所示，该分类中共有2 251个基因注释，共39种功能分类。其中按照分子功能注释，WCO-9所涉及基因在GO-CC分类的有3 010个，前3种功能分别是细胞膜、细胞膜部分和细胞。按照分子功能注释，WCO-9所涉及基因所属的GO-MF分类有2 714个，前3位功能分别是催化活性、结合和转运活性，具有甘油三酯脂肪酶活性的基因有 GE001015、GE001718、GE001892、GE001931、GE002660。按照生物学过程分类，基因所属的GO-BP分类有3 884个，得到注释最多的3种途径分别是代谢过程、细胞过程、单生物过程。

图4 产脂肪酶菌株WCO-9基因功能注释GO功能分类Fig.4 GO function classification map of lipase-producing strain WCO-9’s gene functions

2.4.2 KEGG数据库注释 将产脂肪酶菌株WCO-9的氨基酸序列与KEGG数据库进行BLAST比对，得到功能注释结果。该菌株在KEGG数据库中共有1 602个基因分别在环境信息处理、遗传信息处理和新陈代谢3大功能50个通路上得到功能注释，结果如图5所示。其中983个基因在代谢通路上获得注释，41个代谢通路中，氨基酸生物合成相关的基因高达100个，占代谢通路注释基因的10.17%，其中与脂肪代谢相关基因的Pathway通路信息及其Pathway ID如表2所示。134个基因在环境信息处理层面注释，其中与膜运输相关的基因为54个，与双组分体系信号传导系统相关的基因有54个。

图5 产脂肪酶菌株WCO-9基因功能注释KEGG代谢通路Fig.5 KEGG metabolic pathways annotated with the gene functions of lipase-producing strain WCO-9

表2 产脂肪酶菌株WCO-9基因组脂肪代谢降解通路及相关基因Table 2 Fat metabolism and degradation pathways in lipase-producing strain WCO-9 genome and their related genes

2.4.3 COG数据库注释 将获得的数据与COG蛋白数据库进行比对，获得细菌完整基因组编码蛋白系统进化关系分类（图6）。在不同的功能类中，基因所占比例反映对应时期和环境下代谢或者生理偏向等内容，可以结合研究对象在各个功能类别的分布做出科学解释。

图6 产脂肪酶菌株WCO-9 COG功能分类Fig.6 COG function classification chart of lipase-producing strain WCO-9

2.5 菌株WCO-9比较基因组学分析

2.5.1 Acinetobacter属菌株基因组比较分析 为比较WCO-9菌株与不动杆菌属中亲缘关系较近菌株的差异性，将3株菌株基因组特征进行统计，结果如表3。在这4株菌的全基因组信息中，Acinetobacter baumannii ATCC 19606可预测的编码基因最多。4株菌的基因组大小和GC含量相似，基因组大小在3.19-3.93 Mb，GC含量在38.47%-42.48%。

表3 菌株WCO-9与3株不动杆菌全基因组序列基本特征比较Table 3 Comparison of basic characteristics of whole genome sequences of strain WCO-9 and 3 strains of Acinetobacter

2.5.2 共线性分析 基于系统发育树分析选取同源关系最近的ATCC 17908菌株与目标菌株WCO-9基因组进行Mauve共线性比对，快速分析基因组之间有无大片段序列重排现象。从图7可以看出，WCO-9与ATCC 17908之间的共线性关系较差，存在大量的插入、缺失、倒位和易位等基因重排事件，说明WCO-9菌株在特殊油污土壤环境中可能进化出一套适应新环境基因组的现象。

图7 菌株WCO-9与菌株ATCC 17908基因组共线性分析Fig.7 Genomic collinearity analysis of strain WCO-9 and strain ATCC 17908

2.5.3 菌株WCO-9脂肪酶相关基因序列分析 由数据库注释分析可知，WCO-9菌株全基因组序列中含有11个编码脂肪酶的基因（表4）。通过BLAST比对分析获得预测的脂肪酶的相似性，从表中可以看出，GE001931氨基酸序列相似度最低（90.76%），推测其为一个新型脂肪酶基因。在基因功能注释分析中，将WCO-9菌株与Pfam蛋白质家族数据库进行比对，获得3个脂肪酶分子伴侣（表4）。另外，将这14个基因与ATCC 17908菌株中的基因进行比对的过程中，发现脂肪酶基因GE001931与脂肪酶分子伴侣基因GE000502在ATCC 17908菌株中没有相对应的基因。值得注意的是在脂肪酶基因中，GE001701与GE001702与参考菌株ATCC 17908中的编码基因差异很大，分别为42.90%和40.29%。

表4 脂肪酶基因与NCBI数据库中基因序列相似度Table 4 Sequence similarity between lipase genes and genes in NCBI database

3 讨论

微生物适应性进化很大程度受环境因子驱动，油污环境中更易进化出降解油脂的脂肪酶产生菌［15］。基于挖掘新型特异脂肪酶基因的目标导向，前期从厨余废油污染的土壤中筛选获得一株高产脂肪酶菌株WCO-9，从菌落形态、生理生化和分子水平初步鉴定该菌为琼氏不动杆菌（Acinetobacter junii）。已有大量文献报道，不动杆菌属微生物具有产脂肪酶的能力［16-21］，其中一些不动杆菌能够产低温脂肪酶［22-23］。本研究筛选的琼氏不动杆菌WCO-9发酵液中脂肪酶活力表现极佳，具有重要研究价值。

系统发育分析显示不动杆菌属来源的脂肪酶为细菌脂肪酶第I亚家族（I.1）［24-25］，与琼氏不动杆菌、抗辐射不动杆菌和鲍曼不动杆菌亲缘关系较近。通过比较WCO-9菌株与同源性最高的A.junii ATCC 17908菌株的脂肪酶活力，发现WCO-9菌株的脂肪酶水解活力均显著高于ATCC 17908菌株。然而，近年来虽有多株不动杆菌属脂肪酶的报道，也有研究者采用紫外诱变育种、克隆脂肪酶基因构建工程菌等多种方法提高菌株降解油脂的能力，但仍存在菌株所产酶活力较低的缺点，如Snellman等［26］从Acinetobacter sp.RAG-1中克隆表达了胞外脂肪酶LipA，该酶对底物对硝基苯基脂肪酸酯具有普适性，对中等长度酰基链C6的降解能力最强，接近3 U/mL；Zheng等［27］从Acinetobacter sp.XMZ-26中获得脂肪酶Lip26，其水解豆蔻酸对硝基苯酯酶活力为30 U/mL；桑鹏等［28］从云南热泉底泥中筛选的不动杆菌属耐高温脂肪酶产生菌Acinetobacter sp.Lip-43，采用棕榈酸对硝基苯酯（C16）作底物测定的脂肪酶活力仅为106.5 U/mL。而本研究中WCO-9菌株对ρ-NPC10底物表现出最高活性，接近2 500 U/mL，远高于所报道的不动杆菌属脂肪酶活力。表明WCO-9菌株与其同属菌株相比，具有独特的高效产脂肪酶能力。

随着测序成本降低和测序技术快速发展，全基因组测序已然成为最简洁、有效、快速的挖掘特异功能基因、探明作用机制的有力工具。陈体强等［29］采用PacBio SMART 技术完成了对紫芝栽培品种‘武芝2号’的测序工作，发掘了漆酶同工酶基因、鲨烯合酶、羊毛甾醇合酶基因等代谢相关功能基因，为紫芝栽培品种（系）的分子鉴定系统建立和品种改良提供可靠信息。Singh等［30］将鲍曼不动杆菌AB030与高抗性病原菌LAC-4进行了基因组和表型比较，发现AB030中包含许多LAC-4不存在的抗生素耐药和毒力相关基因。本研究结合二代和三代测序技术对菌株WCO-9全基因组进行精细测序、分析和功能注释，从分子层面对该菌株的生物学特性和基因功能进行了分析。注释结果表明该菌株涉及脂质分解代谢的相关基因较为丰富，这些代谢途径及基因与菌株产脂肪酶密切相关，由此推测产脂肪酶菌株WCO-9拥有一套完备的高效脂肪酶合成路径和分泌体系，解释了WCO-9菌株对油脂具有较强分解能力的原因。

基因组共线性分析显示WCO-9与ATCC 17908菌株基因组差异较大，表明WCO-9菌株可能为琼氏不动杆菌新亚种，其形成是由于长期环境选择压力驱动所致。在长期选择压力下，菌株通过基因水平转移或定向进化在局部共线区域扩充基因以增加新功能，更好地适应复杂多变环境［31］。因此，WCO-9可能存在一套高产且胞外分泌的新型脂肪酶合成路径，具有良好的研究价值与应用前景。通过比较基因组学分析挖掘出WCO-9的14个脂肪酶基因及分子伴侣基因中，GE001931为该菌所特有的脂肪酶基因，推测其可能是WCO-9菌株脂肪酶活性远高于亲缘关系最近的ATCC 17908对照菌株的主要原因。3个脂肪酶分子伴侣可能参与脂肪酶的表达分泌途径，辅助脂肪酶蛋白空间结构的形成，其中ATCC 17908中未发现分子伴侣GE000502的同源基因，且脂肪酶GE001701和GE001702在菌株ATCC 17908的同源性很低，由此推测两株菌的较大基因组差异影响了各自甘油三酯的代谢通路，最终导致脂肪酶活性的差异。

4 结论

本研究报道了一株高产脂肪酶菌株WCO-9的全基因组序列，并通过基因功能数据库注释与比较基因组学分析了该菌株高产脂肪酶活性的原因。脂肪酶产生菌WCO-9的基因组大小为3.19 Mb，GC含量38.62%，含有2 929个编码基因。其中含有11个具有脂肪酶活性的基因，3个脂肪酶分子伴侣基因，1个特异性脂肪酶基因，2个与对照菌株差异较大的脂肪酶基因；因WCO-9菌株中特异脂肪酶基因的存在及部分基因对甘油三酯代谢的影响，导致了其酶活远高于对照菌株ATCC 17908。