场景恐惧记忆过程中小鼠海马区神经可塑性改变的实验研究*

欧阳一蕙 陈 思 何本宇

1 清远职业技术学院，广东省清远市 511510； 2 遵义医科大学珠海校区

创伤后应激障碍(Post-traumatic stress disorder，PTSD)是指机体经历了威胁生命的应激事件后表现出的迟发性和持续性心理障碍[1]。现有对PTSD的研究通常采用基于典型的巴普洛夫条件反射的条件性恐惧记忆模型来模拟出恐惧记忆的学习、重现和消退过程。对处于曾经的恐惧环境以及线索条件下的动物表现出的僵直行为指数进行评估。

PTSD的病理症状涉及的主要脑区为海马(hippocampus)，被认为是对上下文处理和空间记忆最重要的大脑区域，起着产生、传递或巩固情景恐惧记忆的作用[2]。临床实验也证实海马功能的异常导致 PTSD 患者陈述性记忆的损害以及识别环境安全性的能力缺陷[3]。

树突棘是兴奋性突触的突出部位，树突棘密度及形态的变化被认为是突触可塑性的反映，与记忆的形成与重现密切相关[4]。谷氨酸是哺乳动物中枢神经系统中分布最为广泛的兴奋性神经递质，其与受体的结合可通过突触传递调控负责信息传递的新蛋白的合成，进而形成记忆。谷氨酸摄取和谷氨酸—谷氨酰胺循环对突触形成及维持突触可塑性具有重要作用[5]。

然而，在PTSD 中研究谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase，GS)的变化鲜有报道，本研究借助恐惧记忆模型研究海马脑区内树突棘的改变、重要的神经递质谷氨酸和主要调控谷氨酸合成的关键酶谷氨酰胺合成酶的改变，为PTSD应激状态下脑区的神经突触可塑性的研究提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物分组及模型构建

1.1.1 动物分组：本实验选用30只清洁级成年雄性C57小鼠，体质量20～30g，由中山大学中山医学院实验动物中心提供(动物许可号：SCXK 2011-0029)。实验期间动物均饲养于实验动物中心Ⅱ级实验室，室内恒温22～25℃。实验小鼠随机分成：正常对照组(Ctrl)15只、PTSD 组15只；每组中5只用于树突棘染色，10只用于Glu 检测和GS 检测。

1.1.2 场景恐惧记忆模型构建：训练箱箱壁由透明有机玻璃组成(20cm×23cm×20cm)。底部由不锈钢管组成，可以通过电流。电刺激由程序控制电刺激器产生。实验环境房间明亮、安静，训练箱在每只小鼠训练前都用75%酒精擦拭干净，保持空气干燥，无异味，以免对小鼠产生干扰。适应(第1天)：将小鼠轻轻放入恐惧箱让其自由探索5min。训练(第2天)：将小鼠轻轻放入恐惧箱让其自由探索2min后给予2s，0.6mA的电击刺激条件刺激，间隔60s后再给予相同足部电击。最后允许自由探索1min，然后移出训练箱。测试(第3天)：将小鼠轻轻放入恐惧箱让其自由探索5min，记录小鼠在整个过程中僵直不动的时间。僵直时间的比例反映小鼠对场景恐惧记忆的保持能力。

1.2 树突棘的密度检测

1.2.1 取材：小鼠于训练后6h或24h后进行场景恐惧记忆测试，测试后立即常规麻醉处死后快速灌注生理盐水约120ml，直至血液澄清。之后立即取脑，用手术刀将包含海马和前额叶的脑组织切成0.5cm厚的组织块。组织预处理：将组织块立即转移浸泡于预先配置好的高尔基固定液中，20ml/2块组织块。常温避光放置2周。2周后转移到30%蔗糖溶液中(蒸馏水配置)，4℃避光存放48h。

1.2.2 切片：在蒸馏水中使用振动切片机将组织块缓慢切成150μm的厚切片，盛放在装满蒸馏水的六孔板中，在摇床上缓缓摇动，清洗，置于4℃暂时避光保存。

1.2.3 染色：取出切片，将其小心裱片于防脱载玻片上，稍阴干。放在装有水的避光湿盒中，以保持组织片常湿润。使用GENMED试剂盒，小心用移液枪滴加Reagent C清理液孵育1min，吸去，以清理组织片上的杂质。小心用移液枪滴加Reagent D染色液孵育30min,用量以覆盖整个样本表面为准。小心吸移去切片上的染色液。再次用Reagent C清理液孵育1min, 吸去，以清理组织片上残留的染色液。再小心用移液枪滴加预先配置好的染色工作液(显色液A+显色液B为1∶1配置)孵育10～25min，用量以覆盖整个样本表面为准,直至呈现黑色且染出树突棘，即可终止，过程中可于显微镜下观察染色情况。再次用Reagent C清理液孵育1min，吸去，以清理组织片上的杂质，移去清理液后稍阴干后，用中性树脂封片。可于显微镜下拍照。过程全程避光。

1.3 谷氨酸与谷氨酰胺合成酶酶活的检测

1.3.1 谷氨酸检测：收集组织到离心管内，离心后弃上清；称取约0.1g组织，加入1ml试剂一进行冰浴匀浆,10 000r/min，常温离心10min，取上清待测。酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。制备标准溶液：分别稀释为梯度标准溶液。准备测定：标准管：96 孔板中加入40μl标准溶液、160μl试剂三和10μl试剂四混匀，立即记录340nm处 20s时的吸光值为A1和5min20s时的吸光值A2。计算ΔA=A2-A1。测定管：在96孔板中加入40μl样本、160μl试剂三和10μl试剂四混匀，立即记录340nm处20s时的吸光值为A1和5min20s时的吸光值A2，计算ΔA=A2-A1。标准曲线的绘制：以谷氨酸含量(μmol/ml)为x轴，标准管ΔA为y轴，绘制标准曲线y=kx+b。将测定管ΔA代入方程得到x值。按照样品鲜重计算谷氨酸含量(μmol/g 鲜重)=x×V样本÷(W÷V样总×V样本)=x÷W。

1.3.2 谷氨酰胺合成酶酶活检测:样本处理：称取约0.1g组织，加入1ml提取液进行冰浴匀浆。8 000g，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。测定步骤：酶标仪预热30min以上，调节波长至540nm，蒸馏水调零。按说明书加入试剂一～三，混匀，静置10min后，5 000g，常温离心10min，取200μl上清液至96孔板中，测定540nm处的吸光值A。ΔA=A测定管-A 对照管。酶活计算：按样本鲜重计算：单位的定义：每克组织在反应体系中每分钟使 540nm下吸光值变化0.005定义为一个酶活力单位。GS(U/g 鲜重)=ΔA×V反总÷(V样÷V样总×W)÷0.01÷T =38×ΔA÷W。V反总：反应体系总体积，400μl=0.4ml；V样：加入样本体积，70μl=0.07ml；V样总：加入提取液体积，1ml；T：反应时间，30min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样品质量，g。

2 结果

2.1 海马区树突棘的改变 海马中树突棘的变化可借助高尔基染色对其进行特异性的组织病理学标记。研究结果显示24h后检测恐惧记忆后取海马脑区再检测CA1 区的树突棘改变。场景恐惧训练任务在24h内显著增加树突棘的密度。与对照组相比，PTSD组树突棘密度有显著增加。见图 1(PTSD 组：12.36±2.90，Ctrl 组：9.57±2.97，P<0.05，n=18 dendrites from 4 mice per group)。

图1 两组小鼠海马区树突棘的密度改变情况

2.2 场景恐惧记忆过程中海马Glu 的改变 海马中兴奋性神经递质变化可借助灵敏的试剂盒对海马区的谷氨酸进行检测。研究结果显示24h后检测恐惧记忆后取海马脑区再检测CA1 区的谷氨酸。场景恐惧训练任务在 24h内显著增加。与对照组相比，PTSD组谷氨酸有显著增加。见图2a(PTSD 组：6 360.87±607.00，Ctrl 组：4 434.08±1 383.55，P<0.05，n=6 per group)。

2.3 场景恐惧记忆过程中海马GS 的改变 海马中谷氨酸合成酶可借助灵敏的试剂盒对其进行检测。研究结果显示24h后检测恐惧记忆后取海马脑区再检测CA1区的谷氨酸合成酶的酶活性。场景恐惧训练任务在24h内显著增加。与对照组相比，PTSD组谷氨酸合成酶的酶活性有显著增加。见图2b(PTSD 组：28.67±7.96，Ctrl 组：19.93±1.34，P<0.05，n=6 per group)。

图2 两组小鼠海马区谷氨酸浓度水平和谷氨酰胺合成酶的酶活改变情况

3 讨论

本研究结果提示了场景恐惧记忆模型中，海马区的树突棘密度相较于正常小鼠有所增加，兴奋性神经递质谷氨酸在海马区有显著的提高。并且进一步探查影响谷氨酸的关键酶，谷氨酰胺合成酶，表达也有所增加。以上结果提示了在以单纯场景的记忆模型中海马的神经活动增强，形态学和功能学可塑性发生改变，并且可能通过谷氨酸—谷氨酰胺代谢偶联活动增加来调控记忆的形成，为揭示记忆的形成机制和PTSD 的发病机制上提供了一定的理论依据。

树突棘密度有所增加，这与既往文献一致。树突棘的密度增加提示形态学可塑性增强，形态学的改变提示了存在着新蛋白的合成[6]，而形成这些新的蛋白与突触之间的神经递质的不断补充和神经活动的增强密切相关。谷氨酸的浓度在一定范围内的提高可以激活谷氨酸能神经元，维持和提高突触的信息传递。谷氨酸浓度的显著提高有利于增强突触之间兴奋性信息的传递[7]。越来越多的证据显示谷氨酸能神经递质功能障碍(尤其是NMDA受体功能损害时)会表现出神经退行性痴呆的临床症状和疾病进展。在既往的神经精神疾病的研究中，在AD 病人的脑内研究中有使用非竞争性NMDA受体拮抗剂美金刚增加NMDAR进行治疗[7]。新近研究也证实，通过激活谷氨酸能受体可以有效改善AD病人的症状。而在场景恐惧记忆为模型的PTSD 疾病研究中，研究其谷氨酸能受体较多，且也有小鼠实验证据表明谷氨酸能受体激活后，僵直不动的比例得到增加，记忆可得到更好的巩固和加强。

另一方面，谷氨酸作为脑内最主要的兴奋性神经递质，在突触前被释放后主要被星形胶质细胞上的谷氨酸转运体GLT-1或者GLAST所摄取，之后再由胞内的谷氨酰胺合成酶催化合成谷氨酰胺。合成的谷氨酰胺则被运回突触前的神经末梢，转化成谷氨酸或者GABA再次利用，即谷氨酸—谷氨酰胺循环[8]。Glu-Gln 循环被广泛认为与记忆形成和突触传递有关。这种循环依赖于神经元和星形胶质细胞之间的双向通讯[9]，其中，仅存在与星形胶质细胞的谷氨酰胺合成酶对谷氨酸的代谢被认为是维持脑内神经递质谷氨酸和GABA平衡的关键[10]。本研究检测到谷氨酰胺合成酶的酶活性上调，结果提示该代谢偶联机制得到增强。提示了恐惧记忆的形成过程中可能通过触发了该潜在机制引起谷氨酸的上调，进而引起记忆的形成。更进一步，作为其唯一表达该酶的细胞—星形胶质细胞，提示了这类原本起支撑、免疫作用的细胞类型在恐惧记忆的形成过程中扮演一定的作用。这与新进研究中对GFAP和记忆之间的研究结果一致[10]。对星形胶质细胞的研究在多种神经精神疾病中发现其具有重要作用。有研究表明星形胶质细胞中的谷氨酰胺合成酶的功能紊乱在癫痫发作的形成和传播中有重要作用。另也有研究显示，GS的损伤可能会引起谷氨酸在胞外的大量堆积，扰乱神经递质的代谢、合成，从而增强癫痫发作易感性[4]。

综上所述，场景恐惧记忆过程中海马区发生了形态学和功能学的神经可塑性改变，其中兴奋性神经递质谷氨酸得到显著上调，可能是由于谷氨酸—谷氨酰胺代谢偶联的潜在机制导致。而后续研究将进一步探讨在PTSD状态下谷氨酰胺合成酶被活化及其参与恐惧记忆形成的机制。