两种免疫性卵巢早衰大鼠模型的构建与比较

阮菲 沈炜 周卫民

卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）是指女性在40 岁之前出现的卵巢储备功能衰竭的一类疾病，表现为闭经、不孕甚至伴有围绝经期症状，医学检测一般为促卵泡生成素（FSH）升高、雌激素（E2）指标下降等情况［1-2］，近年来，卵巢早衰的发病率成逐年上升和低龄化趋势。卵巢早衰的发病因素复杂，发病机制也不明确，已知的与遗传、免疫、环境和不良生活方式、酶缺乏等因素相关，临床调查发现，放化疗、免疫制剂治疗等因素导致的免疫性卵巢早衰占卵巢早衰发病率的10%～30%［3-4］，该类患者早期不易诊断，后续治疗比较困难。作者在长期研究过程中发现［5-10］，顺铂腹腔注射和雷公藤多苷口服灌胃制作的模型成模率高，而且模型较稳定，因此本文拟对这两种因素构建的大鼠免疫性卵巢早衰模型进行比较研究，并初步探讨其发病机制，为治疗免疫性卵巢药物的筛选提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料（1）实验动物：雌性SD 大鼠50 只，6～8周龄，体重180～220 g，购自上海西普尔必凯实验动物有限公司［SCXK（沪）2018-0006］。饲养于浙江中医药大学动物实验研究中心［SYXK（浙）2018-0012］，环境温度（22±2）℃，相对湿度50%～69%，光照：12 h/12 h 明暗交替，噪声＜50 dB；在独立通气笼具（IVC）内自由进食。所有实验步骤均按照中国关于实验动物使用和护理的立法进行，并经浙江中医药大学动物实验研究中心动物福利与伦理审查委员会批准（20190826-01）。（2）实验试剂：顺铂（江苏豪森药业集团有限公司，601191202），雷公藤多苷片（浙江得恩德制药股份有限公司，2005108B），乌拉坦（上海国药集团化学试剂有限公司，20130609），苏木色精（上海伯奥生物科技有限公司，180701），曙红Y（国药集团话要试剂有限公司，20171112），补加乐（拜尔医药，20210119），FSH、促黄体生成素（LH）和E2试剂盒（南京建成）。（3）实验仪器：ASP200S 封闭式组织脱水机（Microm，德国）；包埋机（Microm，德国）；半自动石蜡切片机（Microm，德国）；自动染色剂（Microm，德国）；数字病理切片（荧光）扫描分析仪（VS120-S6-W，Olympus，日本）；Odyssey 近红外双色激光成像系统（美国LI-COR，Odyssey CLx），垂直电泳系统（美国BIO-RAD，mini-PROTEAN），蛋白转移系统（美国BIO-RAD，PowerPac）。

1.2 方法（1）动物分组及实验干预：SD 大鼠分为5组：正常组（n=16，8 只作为顺铂对照，8 只作为雷公藤多苷对照），雷公藤多苷模型组（7.5 mg/kg，灌胃，n=8），雷公藤多苷模型治疗组（雷公藤多苷7.5 mg/kg，补佳乐0.15 mg/kg，灌胃，n=8），顺铂模型组（顺铂2 mg/kg，腹腔注射，n=8），顺铂模型治疗组（顺铂2 mg/kg，腹腔注射，补佳乐0.15 mg/kg，灌胃，n=8）。雷公藤多苷灌胃14 d 后，治疗组开始灌胃给药补佳乐21 d；顺铂腹腔注射7 d 后，治疗组灌胃补佳乐21 d。（2）大鼠一般情况观察：每两天记录大鼠体重、活动情况、毛色、粪便和死亡等情况。（3）大鼠动情周期观察：每天早上给药前记录阴道图片，然后行HE 染色，显微镜下观察大鼠动情周期改变。（4）大鼠血清性激素测定：于造模前、造模完成后和给药结束后大鼠眼眶后脉络丛取血0.5 mL，分离血清，ELISA 法测定大鼠血清中FSH、LH 和E2的浓度。（5）大鼠卵巢组织脏器指数的测定：末次取血后，安乐处死大鼠，迅速分离大鼠卵巢组织，吸干表面血渍和组织液，称重。将一侧卵巢冻存于液氮中，一侧卵巢组织用中性甲醛固定。脏器指数=双侧卵巢重量（g）/大鼠末次体重（g）×100%。（6）大鼠卵巢组织病理学观察：取一侧卵巢进行常规HE 染色后于光学显微镜下行卵巢组织病理学观察。将组织蜡块行免疫组化染色后，高倍镜下连续观察5 个视野，统计阳性细胞率作为观察指标。（7）大鼠卵巢组织免疫组化染色：取冻存的大鼠卵巢组织，提取蛋白后将蛋白煮沸变性，离心分取上清液，变性聚丙烯酰胺不连续凝胶电泳分离蛋白后转膜，经不同抗体孵育后，激光成像系统扫描蛋白条带。

1.3 统计学方法 采用SPSS 21.0 统计软件。计量资料以（）表示，以P＜0.05 为差异有统计学意义，图片分析用NDO.View2 处理。

2 结果

2.1 大鼠一般情况观察 从表1、图1 及实验中可见，顺铂模型组和顺铂治疗大鼠体重从造模开始下降，后缓慢上升，在尾部和腿部出现斑秃等脱毛现象，毛色暗淡，活动减少；雷公藤多苷模型组和雷公藤多苷模型治疗组大鼠体重缓慢增加，活动减少，扎堆。末次称重后，顺铂模型组和顺铂模型治疗组的大鼠体重低于正常组，差异有统计学意义（P＜0.05，n=8）；雷公藤多苷模型组和雷公藤多苷模型治疗组体重与正常组相似，差异无统计学意义（P＞0.05，n=8）。结果显示，顺铂诱导的免疫性卵巢早衰大鼠模型体重明显降低。

图1 各组大鼠体重变化折线图

表1 各组大鼠体重数据［（），n=8］

表1 各组大鼠体重数据［（），n=8］

注：与正常组比较，*P＜0.05

2.2 大鼠动情周期变化 正常组大鼠有规律的动情周期平均为5～7 d；顺铂模型组和雷公藤多苷模型组大鼠动情周期紊乱，无明显的规律，常见动情间期和动情前期的缺失；顺铂模型治疗组动情周期略有恢复，但是动情间期时间延长；雷公藤多苷模型治疗组动情周期略有恢复，但是动情前期偶有缺失。结果表明两种造模方式都可以引起大鼠动情周期紊乱。

2.3 大鼠血清性激素测定 各组大鼠血清性激素水平见表2。

表2 各组大鼠血清性激素水平［n=8，（）］

表2 各组大鼠血清性激素水平［n=8，（）］

注：与正常组比较，*P＜0.05；与顺铂模型组比较，#P＜0.05；与雷公藤多苷模型组比较，△P＜0.05

2.4 大鼠卵巢脏器指数的测定 顺铂模型组［（0.037±0.003）g/g］、顺铂模型治疗组［（0.047±0.002）g/g］、雷公藤多苷模型组［（0.046±0.002）g/g］和雷公藤多苷模型治疗组［（0.054±0.005）g/g］卵巢脏器指数小于正常组［（0.061±0.005）g/g］，差异有统计学意义（P＜0.05）；与顺铂模型组比较，顺铂模型治疗组、雷公藤多苷模型组和雷公藤多苷模型治疗组卵巢脏器指数升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。结果表明两种造模方法均可使大鼠卵巢指数降低。

2.5 大鼠卵巢组织病理学观察 从图2 中可见，正常组大鼠卵巢中各级卵泡数量较多，可见成熟的卵泡；顺铂模型组大鼠卵巢组织中可见炎症细胞浸润，初级卵泡和闭锁卵泡较多，未见成熟的卵泡；顺铂模型治疗组可见炎症细胞浸润，初级卵泡和闭锁卵泡较多，偶见闭锁的次级卵泡，未见成熟的卵泡；雷公藤多苷模型组可见炎症细胞浸润，初级卵泡、次级卵泡和闭锁卵泡较多，未见成熟的卵泡；雷公藤多苷模型治疗组可见炎症细胞浸润减轻，初级卵泡、次级卵泡和闭锁卵泡较多，可见闭锁的成熟的卵泡。病理观察显示，两种模型大鼠卵巢组织均有明显损伤，出现卵巢早衰症状。

图2 各组大鼠卵巢组织HE染色（×100）（1.正常组；2.顺铂模型组；3.顺铂模型治疗组；4.雷公藤多苷模型组；5.雷公藤多苷模型治疗组）

2.6 大鼠卵巢组织免疫组化染色观察 各组大鼠卵巢组织免疫组化染色总光密度数值见表3。各组大鼠卵巢组织磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、蛋白激酶B（AKT）、PAKT、雷帕霉素的哺乳动物靶标（mTOR）免疫组化染色图见图3～6。

图3 各组大鼠卵巢组织PI3K免疫组化染色（×100）（1.正常组；2.顺铂模型组；3.顺铂模型治疗组；4.雷公藤多苷模型组；5.雷公藤多苷模型治疗组）

图4 各组大鼠卵巢组织AKT免疫组化染色（×100）（1.正常组；2.顺铂模型组；3.顺铂模型治疗组；4.雷公藤多苷模型组；5.雷公藤多苷模型治疗组）

图5 各组大鼠卵巢组织pAKT免疫组化染色（×100）（1.正常组；2.顺铂模型组；3.顺铂模型治疗组；4.雷公藤多苷模型组；5.雷公藤多苷模型治疗组）

图6 各组大鼠卵巢组织mTOR免疫组化染色（×100）（1.正常组；2.顺铂模型组；3.顺铂模型治疗组；4.雷公藤多苷模型组；5.雷公藤多苷模型治疗组）

表3 各组大鼠卵巢组织免疫组化染色总光密度数值［n=5，（）］

表3 各组大鼠卵巢组织免疫组化染色总光密度数值［n=5，（）］

注：与正常组比较，*P＜0.05；与顺铂模型组比较，#P＜0.05；与雷公藤多苷模型组比较，△P＜0.05

3 讨论

PI3K 和AKT 信号通路在卵巢组织中细胞增殖、凋亡和自噬过程最主要的信号通路之一，对卵母细胞的生长、原始卵泡的发育以及颗粒细胞的增殖、分化均起到重要的作用［11-12］。mTOR 是PI3K/AKT 信号通路的下游蛋白，AKT 通过磷酸化的Ser-448 位点激活mTOR，进而调控卵泡的发育，有研究表明，mTOR 活化水平下降可导致卵泡发育迟缓；mTOR 的过度表达可损伤乱丘细胞，进而引起胰岛素抵抗影响卵泡的正常发育；卵泡颗粒细胞中mTORC1 的过度活化加速了POF［11］。因此，PI3K/AKT-mTOR 信号通路在卵巢早衰中是比较敏感的存在。本实验大鼠卵巢组织的免疫组化染色验证了顺铂和雷公藤多苷均可以引起PI3K、AKT 的阳性细胞计数高于正常组，说明顺铂和雷公藤多苷均可用于制作大鼠卵巢早衰模型。

雷公藤多苷是临床常用的免疫性疾病治疗药物，具有抗炎、免疫抑制、抗肿瘤等作用，文献报道不良反应发生率为58.1%［13］，以生殖系统毒性最为常见，临床上常见育龄期妇女服用雷公藤导致月经紊乱、月经量少甚至闭经的报导；有文献研究显示大鼠灌服雷公藤多苷后引起动情周期紊乱、卵巢指数下降、雌激素和抑制素B 下降以及卵巢组织各级卵泡数减少和淋巴细胞浸润卵泡的病理改变［14-15］，与本实验研究的结果吻合，说明雷公藤多苷灌胃可以制作稳定的卵巢早衰模型。

顺铂是临床常用的化疗药物，在杀灭肿瘤细胞的同时，对正常细胞也有不同的损伤作用，由于其对卵巢组织的损伤而被用于卵巢早衰动物模型的制作，有研究表明顺铂可以不同程度的损伤不同发育时期的卵泡，抑制卵泡颗粒细胞的生长，诱导其凋亡，从而抑制卵巢功能，进一步发展为排卵减少，导致血清中相应的激素水平发生变化［16］。

通过本次研究发现，顺铂腹腔注射和雷公藤多苷均可制作稳定的卵巢早衰模型，免疫组化染色显示两种药物制作的卵巢早衰模型与大鼠卵巢组织中PI3KAKT-mTOR 信号通路相关。顺铂对大鼠卵巢的损伤更为严重，不仅模型大鼠出现斑秃、体重降低、卵巢指数降低外，而且外周血清性激素的恢复更缓慢，另外，大鼠卵巢组织HE 染色未见成熟的卵泡。雷公藤多苷制作的大鼠卵巢早衰模型较为温和，对于药物治疗后血清性激素的改变、卵巢病理结构的改变较为明显，在本次实验中，更适合于药物的筛选。