微生物检测技术在食品检验中的应用分析

林更涛

摘 要：微生物检验是食品检验中的重点项目，主要检测内容有细菌总数、大肠菌群以及多种致病菌。食品检验中所用的微生物检测技术较多，需要工作人员熟悉各个细菌学项目的微生物检测技术。细菌总数常用的微生物检测技术有平板菌落计数法、2，3，5-三苯基氯化四氮唑（2，3，5-Triphenyltetrazolium Chloride，TTC）法、微菌落法等；大肠菌群常用的微生物检测技术有3M测试片法、SN标准固体培养基法、发酵法等；常见的致病菌沙门氏菌微生物检测技术方法有SC-WS两管法、环介导等温扩增法、沙门氏菌快速测试片法等，应根据实验室条件、检验要求等选择适宜的检测方法。

关键词：微生物检测技术；食品检验；应用

Abstract： Microbiological inspection is a key item in food inspection， the main detection content includes the total number of bacteria， coliform and a variety of pathogenic bacteria. There are many microbial detection techniques used in food inspection， and it is necessary for staff to be familiar with the microbial detection techniques of various bacteriological projects.The commonly used microbial detection techniques include plate colony counting method， 2，3， 5-triphenyltetrazolium chloride （TTC） method， microcolony method， etc. The commonly used microbial detection techniques for coliform include 3M test sheet method， SN standard solid medium method， fermentation method， etc. The common microbial detection methods of pathogenic bacteria salmonella include SC-WS two-tube method， ring mediated isothermal amplification method， salmonella rapid test sheet method， etc. Appropriate detection methods should be selected according to laboratory conditions and inspection requirements.

Keywords： microbiological testing techniques; food inspection; applications

食品安全關系到人们的切身利益，近年来频发的食品安全问题广受关注，已成为社会中的重大问题。微生物因素所致的食品安全问题比较常见，全球每年约有6亿人因食用微生物污染的食品而导致腹泻，食品安全问题应给予高度重视，并采取有效的防范措施[1]。微生物检测技术是一类技术的统称，主要检测食品中的菌落总数、大肠菌群、致病菌等。微生物检测可以反映食品中的微生物种类、数量，对预防及控制食源性疾病、保证食品安全有重要的指导意义。本文主要介绍食品检验中几种常见微生物检验项目的微生物检测方法及其优缺点，旨在更好地服务于今后的食品检验工作。

1 微生物检测的意义

食品大致可以分为2种，即植物性食物、动物性食物，各种微生物分布其中，可以通过微生物检测技术进行检测。有害微生物是食品检验中的重点，微生物检测安全、快速、准确以及成本低。微生物检测在食品检验中应用广泛，可以用于食品生产过程监控、食品安全评价、食品安全监管和食品科学研究等领域，还可以用于防控食源性疾病发生。在发生食源性疾病时，可以用于追溯原因、消除隐患[2]。

2 食品微生物检测技术及应用

2.1 食品检验中细菌总数的微生物检测技术

常用的方法有平板菌落计数法、2，3，5-三苯基氯化四氮唑（2，3，5-Triphenyltetrazolium Chloride，TTC）法、微菌落法等[3]。

细菌总数检测方法中，国家标准方法是平板菌落计数法，该方法将食品样品制备成溶液，使微生物分散成单个细胞，再将稀释的溶液涂在平板上，加入营养琼脂，放入培养箱中培养48 h，使微生物在平板上繁殖成为可见的菌落，取出后进行菌落计数[4]。三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate，ATP）生物荧光法将食品样品制备成为待测溶液，滤掉悬浮颗粒物，取待测液放入测试管，加入荧光素酶试剂，添加稀释液，混匀，10 s内读数，减去空白值，记为样品中ATP发光强度，再进行定量分析。TTC法先配置培养基，采用倾注平板法，放入恒温培养箱内培养48 h，取出后观察显色效果和菌落大小，并计数。微菌落法将消毒后的微孔滤膜放在抽滤系统上，根据食品种类加样1 mL，连续真空泵抽滤，每个样做2个平行样，将滤膜放在恒温培养箱内室温培养3～5 h，取出膜，干燥处理，用透明液固定，放在载玻片上微热透明，加盖玻片，加热固定，冷却后染色，放在显微镜下观察、拍照，计数菌落总数。

平板菌落计数法具有操作容易、技术壁垒低、可以计数和可以观察菌落特征等优势，但吸收量少、容易蔓延、检测耗费时间长、容易受环境杂菌干扰[5]。TTC法检测成本低、简便、快速，但检查耗费时间长、灵敏度低、操作复杂。微菌落法操作简便，对设备要求不高，但检测时间较长[6]。

2.2 食品检验中大肠菌群的微生物检测技术

大肠菌群检验方法有3M测试片法、SN标准固体培养基法、发酵法等[7]。①3M测试片法。将食品样品稀释成样品稀释液，取稀释液接种至大肠菌群测试片上，放入恒温培养箱中培养24 h，取出观察，选取有气泡的红色菌落计数，计算平行样的平均值，得出大肠菌群数。②SN标准固体培养基法。将食品样品稀释，制备待测溶液，取稀释液接种于平皿，加入培养基培养18～24 h，取出观察。选取紫红色、周围有红色的胆盐沉淀环的菌落，转种至煌绿乳糖胆盐肉汤，放入培养箱内培养48 h，观察产酸产气情况，计算大肠菌群数。③发酵法。乳糖发酵，将食品样品制备成为可检测的待测溶液，取待测溶液分成3份，按照不同浓度稀释，分别接种乳糖胆盐发酵管，放在恒温培养箱中培养4 h，观察产气情况。分离培养，选出乳糖发酵中产气的发酵管，转种至伊红美蓝琼脂平板上，放入恒温培养箱培养18～24 h，观察产气情况，并进行革兰氏染色、镜检。开展复发酵试验，選出分离培养中产气的发酵管，挑选可疑菌落进行革兰氏染色，并接种至乳糖发酵管，放入恒温培养箱中培养24 h。若发酵管产气、革兰氏染色为阴性反应的无芽孢杆菌，则提示大肠菌群阳性。④快速荧光法。将待测溶液加入含有4-甲基伞形酮-β-半乳萄糖苷肉汤管中，放入恒温培养箱中培养24 h，使用紫外灯照射观察，如果有可见荧光，则提示大肠菌群阳性。3M测试片法检测快速，可以缩短2～5 d的微生物检测时间，节省人力物力，检测成本低，但容易受到外界因素的影响[8]。SN标准固体培养基法的优点是操作简便、设备投入少、检测成本低廉、几乎不产生污水，不足之处是检测效率低、劳动量大、不易自动化[9]。发酵法的优点是容易、准确度高、价格便宜、易于推广，不足之处是操作步骤烦琐，耗费时间长，培养基保存时间短[10]。

2.3 食品检验中沙门氏菌的微生物检测技术

食品中沙门氏菌的微生物检测技术有SC-WS两管法、沙门氏菌快速测试片法等[11]。①SC-WS两管法。取食品样品制备成待测溶液，放入恒温培养箱中培养8～18 h。取1 mL培养过的样品混合物接种于四硫磺酸钠煌绿增菌液，42 ℃培养18～24 h，另取1 mL转种于亚硒酸盐胱氨酸增菌液，36 ℃培养18～24 h。取增菌液接种于亚硫酸铋琼脂平板、木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂平板，或采用HE琼脂平板、沙门氏菌属显色培养基平板，36 ℃培养18～24 h，其中亚硫酸铋琼脂平板延长至40～48 h，观察各平板上的菌落并鉴定。②环介导等温扩增法。将分离的沙门氏菌接种在营养肉汤中，室温培养过夜，取0.5 mL离心，取沉淀加灭菌双蒸水重悬，水浴煮沸，再次离心，取上清，用无菌双蒸水调整脱氧核糖核酸（DeoxyriboNucleic Acid，DNA）浓度作为模板。根据沙门氏菌的invA基因的6段序列，应用软件设计引物。按照DNA扩增试剂盒说明书进行扩增，设置阴性对照、阳性对照，扩增反应结束后，反应液变为绿色说明为阳性。③沙门氏菌快速测试片法。先进行增菌培养8～24 h，培养温度41.5 ℃。将3M沙门氏菌SALX测试片放在平坦的表面，于测试片中心滴加无菌水进行水化，将3M压板放在测试片中心，加压，使无菌水均匀分布，室温避光静置1 h。蘸取样品从上至下划线使菌落分离，将膜放下，着色面朝上水平放置，41.5 ℃培养24 h。选出有黄色晕圈、伴或不伴气泡的红色菌落标记测试片。去除测试片最上层的膜，插入3M PetriflmTM SALX确认片，41.5 ℃培养4～5 h，标记的部位若出现有蓝色沉淀的黑色菌落，或者黑色菌落中心伴深红色或蓝色沉淀，视为沙门氏菌阳性。④聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）法。提取食品样品中细菌基因组DNA，准备装有反应液的PCR管，添加模板，设置空白对照、阴性对照、阳性对照，进行PCR扩增反应，使用荧光定量PCR仪检测，根据检测结果判定是否含有沙门氏菌[12]。⑤电阻抗法。取样品接种于乳糖肉汤中，添加标准菌株，放在恒温培养箱中24 h前增菌，取培养过的混合物1 mL，加入装有电阻抗选择培养基Ⅰ、Ⅱ的电阻抗测量瓶中，摇匀，使用电阻抗测量仪检测，并设置阴性对照（未加样品的电阻抗选择培养基测量瓶），24 h内培养基电阻抗变化值超过5%视为阳性。

SC-WS两管法的优点是检测灵敏度高、符合率高，不足之处是检测时间长。环介导等温扩增法具有简便、快速、精确、灵敏度高和特异性强的优点，检测成本远低于荧光PCR。PCR法具有操作简便、检测时间短等优势，但容易出现假阳性，导致结果误判[13]。电阻抗法的优点是高敏感性、高特异性、可重复性好和检测时间短，但用于大量样品检测所需时间仍然较长，推广应用受限。

2.4 其他致病菌检验中的微生物检测技术

食品微生物检验中，常检验的致病菌有单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌等[14]。①单增李斯特菌的微生物检测技术有最大或然数（Most Probable Number， MPN）法、3M纸片法等[15-16]。MPN计数法将不同稀释度的稀释液作为原液，分别接种至李氏增菌肉汤中，30 ℃培养过夜，将培养物转种于科马嘉显色培养基上，37 ℃下培养24 h，再进行MPN计数。3M纸片法将测试片平放在水平操作台上，分别取不同稀释度的菌液1 mL，滴在测试片中心位置，用压板轻轻压下，放入培养箱中37 ℃培养18 h，对结果进行判读。②金黄色葡萄球菌的微生物检测技术需提取金黄色葡萄球菌DNA，设计特异性引物序列，建立反应体系，进行PCR扩增，将扩增产物进行电泳，利用凝胶成像系统观察结果。

3 结语

微生物污染是影响食品安全的重要原因，微生物检验是食品检验的重点项目，检验内容主要为细菌学检验，包括细菌总数、大肠菌群及各类致病菌，如沙门氏菌、单增李斯特菌等。不同微生物的检测应挑选适宜的微生物检测技术，确保检测结果的准确性。

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