3 种石榴果皮褐变与酚类代谢及能量代谢的关系

刘倩婷，杜佳铭，郭晓宏，候德华，王彩莲，郭晓成，寇莉萍,*

（1.西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西 杨凌 712100；2.西安市农业技术推广中心，陕西 西安 710061）

石榴（Punica granatumL.）是石榴科石榴属重要的经济水果作物，广泛分布于热带和亚热带地区，经过不断的推广与培养，现今世界石榴种质资源已达上千种[1]。中国是世界上石榴种质资源最多、产量最高的地区之一，石榴主产区分布在陕西临潼、云南蒙自、安徽怀远、河南荥阳、四川会理、山东枣庄、新疆叶城和河北石家庄8 处，种植面积与产量覆盖全国80%以上[2]。陕西作为主产区之一，拥有传统石榴品种30余种，其中‘净皮甜’石榴是最为传统的种质资源，具有果大皮薄、酸甜可口等优点[3]。‘突尼斯软籽’石榴自1986年引入我国，在陕西潼关已形成一定的种植规模，此类果具有皮薄籽软、汁多果甜等优点[4]。‘骊山红’石榴经净皮甜石榴杂交选育而来，其果面呈粉红色、果实大、果萼脆、籽粒酸甜适度、汁水充盈。

低温贮存（（4.0±0.5）℃）是应用最广泛且有效的石榴果实贮藏手段之一，通过抑制呼吸速率、降低新陈代谢速率、减缓贮藏过程中营养物质流失来延长石榴的贮藏时间[5]。石榴的低温贮藏通常伴随着低温损伤，其具体表现为果皮凹陷、颜色异常、果皮或果肉褐变、果肉木质化等形式[6]。石榴果皮的褐变直观影响果实的感官品质，且影响果实内在品质。

果皮褐变是引起石榴果实贮藏品质劣变的主要原因之一。褐变的发生一般受温度、湿度、病虫霉菌、逆境胁迫等外在因素与失水、酶作用、能量盈亏等内在因素的影响[7]。石榴果皮褐变通常由酶促褐变引起，其含有的酚类物质在过氧化物酶（peroxidase，POD）和多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）的催化作用下被氧化为醌类物质，此类物质进一步聚合形成深褐色物质，进而使果实组织产生褐变[8]。此外，果皮能量代谢与其代谢酶活性的变化也与果皮褐变存在一定关系，在龙眼、荔枝等果实上已有研究[9-10]，但其与石榴果皮褐变的关系尚鲜有研究。因此，本实验以陕西引进品种‘突尼斯软籽’、传统品种‘净皮甜’和选育品种‘骊山红’3 种石榴为实验材料，研究冷藏过程中石榴果皮褐变与酚类物质代谢和能量代谢之间可能存在的关系，并比较3 个品种石榴的优势差异，旨在为石榴果皮褐变机理的阐明和不同品种石榴贮藏提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

‘突尼斯软籽’石榴采自陕西省渭南市潼关县金桥牧业有限公司，单果质量在330～380 g之间；‘净皮甜’‘骊山红’石榴采自陕西省西安市临潼区华瑞果业专业合作社，单果质量分别在380～430 g和420～480 g之间。采收时选择无病虫病菌侵害、果面完好、色泽明亮、无裂纹和其他明显机械损伤的石榴作原料。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH）、2,2’-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2’-azino-bis-3-ethylbenzothiazoline 6-sulfonic acid，ABTS）、二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）、抗坏血酸（VC）、钼酸、福林-酚（均为分析纯）上海源叶生物科技有限公司；高氯酸、邻苯二酚、愈创木酚、聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVP）、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氯化铝、乙酸钠（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；甲醇（色谱纯）上海麦克林生化科技有限公司。

1.2 仪器与设备

JX5001电子天平 上海浦春计量仪器有限公司；ZONKIA高速冷冻离心机 安徽中科中佳科学仪器有限公司；UV-1990紫外分光光度计 上海佑科仪器仪表有限公司；Spark酶标仪 奥地利Tecan Austria GmbH公司；LC-2030 PLUS高效液相色谱仪 日本岛津公司。

1.3 方法

1.3.1 原料处理

采收后的石榴原料用0.015 mm厚聚乙烯薄膜袋和发泡网包装，运往西北农林科技大学食品科学与工程学院果蔬贮藏与加工实验室，于（4.0±0.5）℃、85%～90%相对湿度冷库中低温贮藏。贮藏过程中每15 d取样，每组实验3 次重复，每次重复5 个石榴果实。实验过程中剥离石榴皮保存于封口袋，于－80 ℃冷冻备用。

1.3.2 褐变指数测定

果皮褐变指数测定参考寇莉萍等[11]的方法。按石榴果皮表面褐变面积分为以下6 级。0级：无褐变；1级：0＜褐变面积比例≤1/20；2级：1/20＜褐变面积比例≤1/10；3级：1/10＜褐变面积比例≤3/10；4级：3/10＜褐变面积比例≤3/5；5级：褐变面积比例＞3/5。

1.3.3 自由基清除能力测定

称取石榴皮样品0.5 g，加入10 mL 75%乙醇溶液研磨提取2 min，于8 000×g、4 ℃低温离心10 min，取上清液（提取液）备用。

1.3.3.1 DPPH自由基清除率测定

DPPH自由基清除率测定参考徐冉冉等[12]的方法。实验前10 倍稀释样品提取液，反应体系：25 μL稀释液、2 mL 80%乙醇溶液、4 mL 0.045 mg/mL DPPH溶液。涡旋混匀后，避光反应30 min，于517 nm波长处测定样品吸光度（A1）。蒸馏水调零，以相同体系不加DPPH溶液为对照，测定吸光度（A0）。按式（1）计算DPPH自由基清除率。

1.3.3.2 ABTS阳离子自由基清除率测定

ABTS阳离子自由基清除率参考徐冉冉等[12]的方法测定。反应体系：20 μL稀释液、1.5 mL 7 mmol/L ABTS溶液（溶于20 mmol/L pH 4.5乙酸缓冲液，含2.45 mmol/L过硫酸钾，黑暗静置16 h后，调节734 nm波长处吸光度至7左右）反应6 min后，加入2 mL 80%乙醇溶液再反应6 min，于734 nm波长处测定样品吸光度（Aj）。蒸馏水调零，以相同体系不加ABTS溶液为对照，测定734 nm波长处吸光度（Ai）。ABTS阳离子自由基清除率按式（2）计算。

1.3.4 酚类物质代谢相关指标测定

1.3.4.1 总酚、总黄酮、花色苷含量

总酚、总黄酮、花色苷含量测定参考徐冉冉[12]及周鹤[13]等的方法，并作适当调整。称取1 g石榴皮，用10 mL 75%乙醇溶液研磨提取后室温浸提24 h，于4 ℃、8 000×g离心10 min，取上清液冷藏备用，实验测定前适当稀释。

总酚含量采用福林-酚比色法测定，提取液20 倍稀释，反应体系：1 mL提取液、5 mL蒸馏水、0.5 mL福林-酚试剂、1.5 mL 20 g/100 mL Na2CO3溶液，避光反应30 min，于765 nm波长处测定OD值。以蒸馏水作对照，以没食子酸为标准品作标准曲线，根据标准曲线方程计算总酚含量，结果以每克样品所含没食子酸质量表示，单位为mg/g。

总黄酮含量采用氯化铝比色法测定，提取液10 倍稀释，反应体系：1 mL提取液、4 mL 75%乙醇溶液、0.5 mL 5 g/100 mL NaNO2溶液，静置6 min后再加入0.5 mL 10 g/100 mL AlCl3溶液，再静置6 min，加入5 mL 1 mol/L NaOH溶液和1.5 mL蒸馏水。以蒸馏水作对照，以芦丁为标准品作标准曲线，根据标准曲线方程计算总黄酮含量，结果以每克样品所含芦丁质量表示，单位为mg/g。

花色苷含量采用pH示差法测定，反应体系：取0.5 mL提取液两份，分别加入4.5 mL KCl缓冲液（0.025 mol/L，pH 1.0）和醋酸钠缓冲液（0.4 mol/L，pH 4.5），室温下平衡20 min，分别在510、700 nm波长处测定OD值。按公式（3）测定花色苷含量。

式中：A＝（A510nm－A700nm）pH1.0－（A510nm－A700nm）pH4.5；m为矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的摩尔质量（449.2 g/mol）；DF为稀释因子（20）；ε为花色苷的摩尔吸光系数（26 900 L/（mol·cm））；1表示比色皿光程（1 cm）；m样表示制备提取液时样品的质量/g；V表示测定时所取提取液体积/mL。

1.3.4.2 多酚氧化酶、过氧化物酶、苯丙氨酸解氨酶活力测定

多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）、过氧化物酶（peroxidase，POD）活力的测定参考寇莉萍等[11]的方法，并稍作修改。称取0.5 g石榴皮用5 mL乙酸-乙酸钠缓冲提取液（内含1 mmol/L聚乙二醇-6000、10 mmol/L VC、4 g/100 mL聚乙烯吡咯烷酮）研磨提取，于4 ℃、8 000×g离心10 min，取上清液待测。

PPO活力测定反应体系：75 μL提取液、3 mL 0.1 mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液（pH 5.5）、0.75 mL 50 mmol/L邻苯二酚溶液，于420 nm波长处测定吸光度，以每克石榴果皮每分钟吸光度变化0.1为1 个PPO活力单位（U）。

POD活力测定反应体系：40 μL提取液、2.4 mL 0.05 mol/L 愈创木酚溶液和160 μL 0.5 mol/L H2O2溶液，于470 nm波长处测定吸光度，以每克石榴果皮每分钟吸光度变化0.1为1 个POD活力单位（U）。

苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonialyase，PAL）活力测定参考周鹤[13]的方法，并适当改动。称取0.5 g石榴果皮，加入5 mL 0.1 mol/L硼酸-硼砂缓冲液（含2 mmol/L EDTA、5 mmol/L巯基乙醇），冰浴研磨1 min，于4 ℃、8 000×g离心10 min，取上清液（酶提取液）0.5 mL，加入3 mL 50 mmol/L pH 8.8硼酸缓冲液，于37 ℃保温5 min，加入0.5 mL 20 mmol/LL-苯丙氨酸溶液，再次于37 ℃保温1 h。保温结束后立即加入0.1 mL 6 mol/L HCl溶液终止反应，于290 nm波长处测定OD值，以每小时酶促反应体系吸光度变化0.01为1 个PAL活力单位（U）。以蒸馏水参比调零，以煮沸15 min灭活酶提取液为对照。

1.3.5 能量代谢相关指标测定

1.3.5.1 ATP、ADP、AMP含量及能荷测定

参考周鹤[13]的方法进行测定。称取0.5 g石榴果皮，用5 mL高氯酸溶液（0.6 mol/L）冰浴研磨，匀浆于4 ℃、8 000×g离心10 min。取上清液2 mL，用1 mol/L KOH溶液调pH值至6.5～6.8，加超纯水定容至3 mL，冰浴30 min后再次离心，上清液过0.22 μm水系膜，保存备用。

采用高效液相色谱法测定三磷酸腺苷（triphosadenine，ATP）、二磷酸腺苷（adenosine diphosphatase，ADP）、一磷酸腺苷（adenosine monophosphate，AMP）含量。测定条件：C18反向色谱柱（4.6 mm×250 nm，5 μm），进样体积20 μL，流速1.0 mL/min，检测波长254 nm，采用梯度洗脱方式，流动相为甲醇（A）和磷酸钾盐缓冲液（B）：0～5 min，100% A；5～7 min，80% A＋20% B；7～9 min，75% A＋25% B；10～20 min，100% A。按公式（4）计算能荷。

式中：cATP、cADP、cAMP分别表示ATP、ADP、AMP含量/（mg/g）。

1.3.5.2 ATPase活力测定

ATPase活力测定参考周鹤[13]的方法，具体包括线粒体膜相关的H＋-ATPase、Mg2＋-ATPase、Ca2＋-ATPase活力。

称取0.5 g石榴皮，加入5 mL提取液（内含5 mmol/L EDTA、5 mmol/L DTT、80 mmol/L Tris、1 mmol/L PMSF、10 mmol/L VC、250 mmol/L蔗糖、5 g/100 mL甘油），冰浴研磨1 min，于4 ℃、8 000×g离心10 min，取上清液冷藏备用。取0.2 mL酶提取液于35 ℃保温3 min，加入0.5 mL ATPase反应液、100 μL钼酸铵溶液（1 mmol/L）、100 μL KNO3溶液（0.5 mol/L）和100 μL Na3VO4溶液（0.5 mol/L），再加入200 μL ATP溶液（5 mmol/L）启动反应后于35 ℃保温20 min，最后加入0.5 mL 20 g/100 mL 三氯乙酸溶液终止反应。4 ℃、8 000×g离心10 min，取上清液0.5 mL，加入2.5 mL蒸馏水和2 mL硫酸亚铁-钼酸铵溶液（5 g 硫酸亚铁中加入10 mL硫酸钼铵酸，再加100 mL蒸馏水溶解），静置反应2 min，在660 nm波长处测定OD值，结果以果皮组织中每小时每毫克蛋白中ATPase分解ATP产生1 μmol无机磷的量为1 个ATPase活力单位，单位为μmol/（mg·h）。以蒸馏水作对照。

其中ATPase反应液如下：H＋-ATPase反应液：50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5）、20 mmol/L MgSO4、0.5 mol/L KCl；Mg2＋-ATPase反应液：50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5）、50 mmol/L NaCl、5 mmol/L MgCl2、2 mmol/L EDTA、5 mmol/L DTT；Ca2＋-ATPase反应液：50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5）、50 mmol/L NaCl、2 mmol/L CaCl2、2 mmol/L EDTA、5 mmol/L DTT。

1.4 数据处理与分析

使用Excel 2016软件进行数据统计与计算，利用Origin 2022软件进行相关性分析（Pearson法）和主成分分析并作图。数据分析工具为Minitab 18.0软件，采用单因素方差分析法分析数据的差异显著性，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 冷藏过程中不同品种石榴果皮褐变指数及抗氧化能力比较

由图1A可知，石榴果皮褐变指数在低温贮藏过程中显著增加（P＜0.05）。其中，‘净皮甜’果皮表现出较易褐变，其褐变指数显著高于其余两个品种（P＜0.05）。‘突尼斯软籽’在贮藏过程中果皮色泽较好，褐变程度最轻。

图1 冷藏过程中不同品种石榴果皮褐变指数与自由基清除能力比较Fig. 1 Comparison of browning index and free radical scavenging capacity of pomegranate husk from different cultivars during cold storage

由图1B、C可知，3 个品种石榴果皮DPPH自由基清除率均呈现先升高后降低趋势，但整体变化范围不大。对于ABTS阳离子自由基清除率，仅‘突尼斯软籽’总体呈现出先升高后降低趋势，而‘净皮甜’保持稳定，‘骊山红’在贮藏15 d后显著下降，30 d后保持稳定。对于果皮DPPH自由基清除率和ABTS阳离子自由基清除率，均是‘突尼斯软籽’显著高于其余两个品种（P＜0.05），而‘净皮甜’在45 d后显著高于‘骊山红’（P＜0.05）。结果表明‘突尼斯软籽’石榴果皮具有优于其余两个品种的抗氧化能力。

2.2 冷藏过程中不同石榴果皮酚类物质代谢比较

2.2.1 冷藏过程中不同石榴果皮总酚、总黄酮和花色苷含量比较

由图2A可知，3 种石榴果皮总酚含量在贮藏过程中波动范围较小。‘突尼斯软籽’果皮总酚含量呈现先升高后降低趋势，在贮藏结束时含量为35.86 mg/g。‘净皮甜’果皮总酚含量在贮藏30 d后保持在17.01～19.06 mg/g之间，变化不显著（P＞0.05）。‘骊山红’果皮总酚含量在贮藏到第60天略微上升，随后下降，到贮藏结束时为17.70 mg/g。其中，整个贮藏过程中‘突尼斯软籽’果皮总酚含量显著高于其余两个品种（P＜0.05）。

图2 冷藏过程不同品种石榴果皮酚类物质含量比较Fig. 2 Comparison of phenolic contents of pomegranate husk from different cultivars during cold storage

由图2B可知，3 种石榴果皮总黄酮含量整体上均呈先上升后下降趋势，但波动较小，贮藏结束时，‘突尼斯软籽’‘净皮甜’‘骊山红’果皮总黄酮含量分别为1.58、0.98、0.97 mg/g。其中，‘突尼斯软籽’石榴果皮总黄酮含量始终显著高于其余两个品种（P＜0.05），在15～60 d，‘净皮甜’果皮总黄酮含量显著高于‘骊山红’（P＜0.05）。

由图2C可知，3 种石榴果皮花色苷含量均随冷藏时间延长先升高后降低，在贮藏结束时‘突尼斯软籽’果皮总花色苷含量为19.3 mg/kg，‘净皮甜’为4.2 mg/kg，‘骊山红’为17.2 mg/kg。在贮藏过程中，‘净皮甜’果皮花色苷含量始终显著低于其余两个品种（P＜0.05），此外，在贮藏30～75 d，‘骊山红’果皮花色苷含量也显著低于‘突尼斯软籽’（P＜0.05）。

2.2.2 冷藏过程中不同石榴果皮PPO、POD和PAL活力比较

由图3A可知，3 个品种石榴果皮PPO活力整体上都是随贮藏时间延长呈现先升高后降低趋势。‘突尼斯软籽’石榴果皮PPO活力总体显著低于其余两个品种（P＜0.05），保持在3.38～4.98 U/（min·g）之间。贮藏0～30 d，‘净皮甜’果皮PPO活力高于‘骊山红’，但在45～90 d其PPO活力均低于‘骊山红’，贮藏结束时‘净皮甜’果皮PPO活力降为5.51 U/（min·g），‘骊山红’的PPO活力为7.82 U/（min·g）。

图3 冷藏过程不同品种石榴果皮酚类代谢相关酶活力比较Fig. 3 Comparison of phenolic metabolism-related enzyme activities of pomegranate husk from different cultivars during cold storage

由图3B可知，‘突尼斯软籽’与‘净皮甜’果皮POD活力在45 d后均呈现显著上升趋势（P＜0.05），而‘骊山红’果皮在30～60 d显著下降（P＜0.05）。在贮藏0～45 d，‘突尼斯’软籽果皮POD活力最低，‘净皮甜’石榴果皮POD活力最高。在贮藏60～90 d，‘净皮甜’果皮POD活力最高，其次是‘突尼斯软籽’。贮藏结束时，‘突尼斯’‘净皮甜’和‘骊山红’果皮POD活力分别为31.2、38.3、11.3 U/（min·g）。

由图3C可知，‘突尼斯软籽’PAL活力在第60天骤增至114.6 U/（h·g），随后呈下降趋势，至贮藏结束时降为72.9 U/（h·g）。而‘净皮甜’与‘骊山红’PAL活力均在小范围内波动，范围分别为18.8～26.0、18.6～31.7 U/（h·g）。在冷藏过程中，‘突尼斯软籽’果皮PAL活力均显著高于其余两个品种（P＜0.05）。

2.3 冷藏过程中不同石榴果皮能量代谢比较

2.3.1 冷藏过程中不同石榴果皮ATP、ADP、AMP含量及能荷比较

由图4A可知，3 种石榴果皮ATP含量在贮藏过程中均呈现先升高后降低趋势，其中‘突尼斯软籽’与‘净皮甜’石榴果皮ATP含量均在第60天达到最大，分别为7.47 mg/g和2.30 mg/g；‘骊山红’果皮ATP含量在第15天最高，为2.33 mg/g。在整个贮藏过程中，‘突尼斯软籽’果皮ATP含量显著高于其余两个品种（P＜0.05）。

图4 冷藏过程不同品种石榴果皮能量物质含量比较Fig. 4 Comparison of energy substance contents in pomegranate husk from different cultivars during cold storage

由图4B可知，‘突尼斯软籽’石榴ADP含量在贮藏过程中呈先升高后降低趋势，在15～75 d其含量显著高于‘净皮甜’与‘骊山红’（P＜0.05），贮藏结束时降为1.17 mg/g。‘净皮甜’果皮ADP含量在贮藏过程中呈上升趋势，除15 d外，整个冷藏过程中略高于‘骊山红’，冷藏结束时为1.72 mg/g。‘骊山红’果皮ADP含量整体上呈现先升高后降低趋势，结束时含量为1.29 mg/g。

由图4C可知，3 种石榴果皮AMP含量均随贮藏时间的延长呈显著增加趋势（P＜0.05）。‘突尼斯软籽’石榴AMP含量仅在45～60 d含量较低，其余时间AMP含量均高于其余两个品种，在贮藏结束时增至1 007.7 μg/g。在贮藏前期（0～45 d），‘净皮甜’果皮AMP含量略高于‘骊山红’，而在贮藏后期（45～75 d），‘骊山红’果皮AMP含量又略高于‘净皮甜’，在冷藏第90天，‘净皮甜’‘骊山红’果皮AMP含量分别为908.1、774.0 μg/g。

由图4D可知，‘突尼斯软籽’石榴果皮能荷在贮藏0～60 d略有上升，随后呈显著下降趋势（P＜0.05）。‘净皮甜’与 ‘骊山红’果皮能荷总体呈显著下降趋势（P＜0.05）。且在冷藏过程中，‘突尼斯’软籽石榴果皮能荷总体上显著高于其余两个品种（P＜0.05）。

2.3.2 冷藏过程中不同石榴果皮ATPase活力比较

由图5A可知，3 种石榴果皮H＋-ATPase活力在贮藏过程中均呈先升高后降低趋势，其中除90 d外，‘突尼斯软籽’石榴的H＋-ATPase活力在整个贮藏过程中均显著高于其余两个品种（P＜0.05）。‘净皮甜’与‘骊山红’果皮H＋-ATPase活力接近。在贮藏结束时，‘突尼斯软籽’‘净皮甜’‘骊山红’果皮H＋-ATPase活力分别为5.73、5.37、6.08 μmol/（mg·h）。

图5 冷藏过程不同品种石榴果皮能量代谢相关酶活力比较Fig. 5 Comparison of energy metabolism-related enzyme activities of pomegranate husk from different cultivars during cold storage

由图5B可知，‘突尼斯软籽’果皮Mg2＋-ATPase活力随冷藏时间延长呈现先升高后降低的趋势，且整个贮藏过程中均显著高于‘净皮甜’和‘骊山红’（P＜0.05），贮藏结束时为6.51 μmol/（mg·h）。‘净皮甜’果皮Mg2＋-ATPase活力随冷藏时间延长也先升高后降低，且在30～75 d显著高于‘骊山红’（P＜0.05），贮藏结束时为5.18 μmol/（mg·h）。‘骊山红’果皮Mg2＋-ATPase活力除第90天外均随时间延长呈显著下降趋势，贮藏结束时为5.33 μmol/（mg·h）。

由图5C可知，3 个品种Ca2＋-ATPase活力在整个贮藏过程中呈波动变化，贮藏结束时 ‘突尼斯软籽’‘净皮甜’‘骊山红’果皮Ca2＋-ATPase活力分别为6.33、7.04、6.52 μmol/（mg·h）。

2.4 石榴果皮褐变与能量及酚类物质代谢相关性分析

‘突尼斯软籽’石榴果皮褐变指数与POD活力和AMP含量呈极显著正相关（P＜0.01）（图6A），‘净皮甜’果皮褐变指数与总酚含量、POD活力和AMP含量呈极显著正相关（P＜0.01），与总黄酮含量、PAL活力和ADP含量呈显著正相关（P＜0.05）（图6B）。‘骊山红’果皮褐变指数与AMP含量呈极显著正相关（P＜0.01），与总酚含量呈显著正相关（P＜0.05），与Mg2＋-ATPase活力呈极显著负相关（P＜0.01），与ABTS阳离子自由基清除率呈显著负相关（P＜0.05）（图6C）。综上，石榴果皮褐变受酚类物质含量、相关酶活力、能量物质含量的影响。

图6 石榴果皮褐变与能量及酚类物质代谢相关性分析Fig. 6 Correlation analysis of pomegranate husk browning with energy and phenolic metabolism

2.5 石榴果皮能量及酚类物质代谢相关指标主成分分析

表1是主成分分析法所得3 个主成分（principal component，PC）因子，累计贡献率达83.540%。其中PC1特征值为9.561，贡献率56.241%；PC2特征值为3.139，贡献率为18.463%；PC3特征值为1.502，贡献率为8.836%。前两个主成分累计贡献率已达74.704%，可基本反映指标间相关信息。

表1 解释的总方差Table 1 Total variance explained

载荷图（图7A）有助于进一步分析各指标之间的相关程度。根据PC1可知，石榴果皮ADP含量、总黄酮含量、DPPH自由基清除率、PAL活力、总酚含量、ATP含量、ABTS阳离子自由基清除率、Mg2＋-ATPase活力、H＋-ATPase活力、花色苷含量、能荷之间存在正相关关系，并且这些指标与褐变指数和PPO活力存在负相关关系。根据PC2可知，褐变指数与POD活力、AMP含量、Ga2＋-ATPase活力呈正相关，与PPO活力呈负相关。从图7B可知，根据PC1可以明显区分‘突尼斯软籽’与其余两个品种，‘骊山红’与‘净皮甜’石榴贮藏品质更为相似。

图7 石榴果皮能量及酚类物质代谢相关指标主成分分析载荷图和得分图Fig. 7 PCA loading and score plots of energy and phenolic metabolismrelated indexes in pomegranate peel

3 讨 论

3.1 3 种石榴果皮褐变与抗氧化能力的差异

冷藏是目前石榴贮藏保鲜最常见的手段，褐变常常发生在贮藏过程中并影响果实品质。首先，石榴果皮含有丰富的多酚类物质[14]，具有强抗氧化活力，其中DPPH自由基与ABTS阳离子自由基清除能力是反映抗氧化活性的具体指标。徐洪宇等[15]研究发现在21 种水果中，石榴果皮总酚、总黄酮含量最高，并且具有较强的抗氧化活性。而徐冉冉等[12]研究发现在贮藏过程中石榴果皮的DPPH自由基与ABTS阳离子自由基清除能力有所减弱。本研究表明‘突尼斯软籽’石榴具有优于其余两个品种的抗氧化能力，且褐变程度在3 个品种中最低。

3.2 3 种石榴果皮褐变与酚类代谢之间的关系及差异

石榴果皮的总酚含量在品种间具有明显差异[15]，有研究表明石榴皮的抗氧化活性与总酚含量之间存在正相关关系[16]。本研究同样发现，在更易发生褐变的‘净皮甜’果皮中，总酚与总黄酮含量与DPPH自由基与ABTS阳离子自由基清除能力均存在显著正相关性。酚类物质是酶促褐变的重要底物，是石榴果皮褐变的重要影响因子，其含量的变化影响果皮的氧化-还原平衡[17]。石榴皮黄酮类化合物含量较高，能降低各类自由基活力，具有强于VC的抗氧化性[18]。石榴果皮花色苷同样具有良好的抗氧化能力，对自由基表现出强清除能力[19-20]。PPO、POD、PAL是酚类代谢中的关键酶。PPO、POD酚类物质被氧化从而加速深褐色物质生成，进而产生褐变[21]。PAL是苯丙氨酸代谢途径中的重要酶，也是酚类物质生成的关键酶，对果皮褐变具有重要影响[7,21]。

本研究结果显示，褐变程度更低的‘突尼斯软籽’石榴总酚、总黄酮含量更高，而其PPO和POD活力相对较低，因此推测‘突尼斯软籽’石榴褐变度低是因为PPO、POD活力较低，对酚类物质的氧化程度较低，从而使酚类物质含量保持较高。而褐变严重的‘净皮甜’石榴PPO、POD活力在贮藏过程中整体上更高。寇莉萍等[11]在茉莉酸甲酯贮藏保鲜‘净皮甜’石榴实验结果中发现，PPO活力在贮藏后期呈现下降趋势，且与褐变指数呈负相关，均与本研究结果一致。何瑛等[22]研究发现石榴果皮褐变底物主要是单宁物质，并且通过对果皮褐变产物的提取、分离和定性定量分析发现褐变产物为蒽醌类化合物，具体包含4 种，分别为大黄酚、大黄素、大黄酸、大黄素甲醚[23]。齐笑笑等[17]还研究了石榴采后果皮非酶褐变反应过程中的酶、底物和产物，结果表明美拉德反应的中间产物5-羟甲基糠醛含量随底物还原糖和氨基态氮含量减少而增加，导致非酶褐变发生，进而对果皮褐变产生影响。故石榴果皮的褐变既有酶促褐变的作用，又存在非酶褐变的影响，深层次的原因还需进一步通过分子生物学进行研究。

3.3 3 种石榴果皮褐变与能量代谢之间的关系及差异

能量是生理代谢的基础，有研究表示果实采后能量状态对果皮褐变具有重要影响[24]，在贮藏过程中果皮ATP、ADP含量和能荷下降，能量代谢失衡，自由基攻击膜脂和大分子使膜脂代谢遭到破坏，同时果实的逆境胁迫抵抗力下降，加速果皮褐变及果实品质劣变[7,24]。现有研究可证实果实能量状态与果皮褐变之间存在密切联系[9-10,25-26]。林毅雄等[9]研究发现龙眼果实在采后贮藏过程中ATP、ADP含量和能荷呈下降趋势，AMP含量呈上升趋势，并且采前喷施胺鲜酯的实验组果实果皮ATP、ADP含量和能荷更高，AMP含量更低，褐变指数上升得更缓慢。李泽等[10]研究发现减压处理后的荔枝果皮能保持较高水平的ATP、ADP含量和能荷，AMP含量上升速率减缓，为果皮细胞膜修复提供了能量，可保护果皮细胞膜的完整性和功能，从而显著降低荔枝果皮的褐变和霉变程度。因此，若贮藏过程中ATP与能荷保持较高水平，AMP维持在较低水平，果实就能维持正常代谢和细胞机能[24-25,27]。本研究结果显示，‘突尼斯软籽’石榴果皮在冷藏过程中保持了更高的ATP、ADP含量和能荷，并且褐变程度更轻。而褐变最严重的‘净皮甜’石榴果皮ATP和ADP含量和能荷均较低。

ATPase存在于细胞的质膜、液泡膜、线粒体膜等细胞器膜上，通过使ATP上的高能磷酸键断裂和连接实现能量释放和贮存，主要包含Mg2＋-ATPase、H＋-ATPase和Ca2＋-ATPase等[28-29]。王志华等[26]在研究苹果果皮褐变时发现当ATP相关酶活力下降时，果实线粒体结构和功能被破坏，线粒体产能效率降低，使细胞能量亏损从而引起果皮褐变。因此ATPase保持高活力，能使果实保持良好的能量平衡，有助于延缓果皮褐变与果实衰老劣变[24]。汪永红等[27]研究发现冷藏能维持红肉蜜柚H＋-ATPase、Ca2＋-ATPase活力，保持ATP、ADP水平和能荷，从而保持果实品质并延长果实的贮藏期。本研究发现褐变程度更低的‘突尼斯软籽’石榴果皮在冷藏过程中维持了更高的H＋-ATPase和Mg2＋-ATPase活力。

综上，通过能量物质与相关酶活力变化可初步探讨得出石榴果皮褐变与能量代谢间的关系，但基于蛋白质组学的能量亏损和调控还需进一步研究。王鹤潼[30]基于金针菇线粒体蛋白表达差异显著，发现与能量代谢相关的生物过程包括碳水化合物分解代谢、谷氨酸分解代谢等，且金针菇能量代谢相关酶表达受抑制时，ATP消耗减少，糖酵解循环呼吸代谢减慢，以此降低金针菇的呼吸速率和褐变速度。能量代谢的分子机制影响生物代谢，进而对果蔬贮藏造成不良影响。

4 结 论

研究结果表明，石榴在（4.0±0.5）℃贮藏过程中果皮褐变逐渐加深，其中‘突尼斯软籽’石榴果皮褐变最轻，‘净皮甜’石榴果皮褐变最严重。与‘净皮甜’和‘骊山红’相比，‘突尼斯软籽’石榴果皮的自由基清除能力、酚类物质含量、PAL活力更高，PPO活力更低。此外，‘突尼斯’软籽石榴还保持了较高的ATP、ADP含量与能荷，其Mg2＋-ATPase、H＋-ATPase活力保持较好，能量状态优于‘净皮甜’和‘骊山红’。相关性分析和主成分分析结果表明，石榴果皮褐变与酚类代谢和能量代谢均相关，石榴果皮的褐变受酚类物质含量、相关酶活力、能量物质含量的影响。本研究立足石榴果皮褐变与代谢关系，发现石榴果皮褐变在品种间呈现的差异与果实在冷藏过程中的酚类代谢及能量代谢密切相关，为深入探究褐变转录组学、代谢组学及蛋白组学提供了方向，进而为选育更耐贮藏、不易褐变的石榴品种提供参考。