紧密连接蛋白介导的十三味辛夷滴鼻剂对小鼠鼻腔黏膜修复机制探究

杨 钤 杨履世 贾力莉 宋美卿 牛艳艳 吉海杰 仲启明 冯玛莉▲

1.山西省中医院临床药理重点实验室，山西太原 030012；2.山西黄河中药有限公司，山西太原 030012

十三味辛夷滴鼻剂是古方苍耳子散、川芎茶调散和加味通关散的合方。苍耳子散出自《济生方》，由苍耳子、辛夷、白芷、薄荷组成，是治疗鼻炎的第一经典药方[1]；川芎茶调散始见于宋代的官方医典《太平惠民和剂局方·卷之二治伤寒》，由薄荷、川芎、荆芥、羌活、白芷、甘草、防风、细辛八味药组成，为“诸经头痛之要药”，治疗头痛的同时养护鼻腔黏膜[2]；加味通关散来源于古方通关散，首见于《丹溪心法附余》，由猪牙皂、细辛、麝香、冰片组成，增强醒神通窍[3]。三药合用，辛温散寒、通窍止痛、消炎解毒。

鼻炎是由各种理化因素、生物因子及免疫相关疾病等诱发的鼻黏膜的炎性反应，病理改变为黏膜充血、水肿、渗出、增生、萎缩甚至坏死等。鼻黏膜修复对于减轻炎性反应、恢复组织病理结构、形成保护屏障、防御病原微生物入侵等具有重要作用。

本研究通过制备小鼠鼻黏膜热损伤模型以及十三味辛夷滴鼻剂滴鼻给药，观察鼻腔黏膜红肿、病理改变，检测鼻黏膜上皮细胞ZO-1、Claudin-1和Occludin表达，以期为十三味辛夷滴鼻剂对鼻黏膜损伤的修复作用及可能的作用机制提供实验证据。

1 材料与方法

1.1 药物

十三味辛夷滴鼻剂（山西黄河中药有限公司，国药准字B20020131，批号：20201001，规格：6 ml/瓶）；用时以十三味辛夷滴鼻剂∶溶媒（不含十三味辛夷滴鼻剂药味的基质）=1∶0、1∶1、1∶3分别稀释为高、中、低不同浓度的混悬液。

滴通鼻炎水（广州白云山制药股份有限公司白云山外用药厂，国药准字Z44022586，批号：F2019，规格：15 ml/瓶）；用时以滴通鼻炎水∶生理盐水=1∶4稀释为混悬液。

1.2 动物

小鼠：KM种，SPF级，体重18～22 g，共60只，雌、雄各半，购自北京华阜康生物科技股份有限公司[生产许可证：SCXK（京）2019-0008，质量合格证：110322210100720285]。饲养于山西省中医药研究院临床药理重点实验室动物房（符合动物实验通用要求），相对湿度40%～60%，室温：22±1℃：自由饮水、摄食。本研究经山西省中医院（本院）伦理委员会审查，实验中涉及的动物处理方法符合国家相关法规（批件号：2021-07028）。

1.3 试剂

ZO-1抗体（bs-1329R）、Claudin-1抗体（bs-1428R）、Occludin抗体（bs-10011R）、免疫组化检测试剂盒（SP-0023），购自北京博奥森生物技术有限公司。

1.4 仪器

全自动组织脱水机（Excelsior）、旋转石蜡切片机（F325）、全自动染色机（Gemini AS），产自美国Thermo；荧光显微镜（BX51-DP72），产自日本Olympus。

1.5 方法

1.5.1 分组 记录小鼠体重，按照“均衡随机”的方法分为空白对照组、模型对照组、滴通鼻炎水阳性对照组[1 μl/（只·次·侧）]、十三味辛夷滴鼻剂高剂量[5 μl/（只·次·侧）]、中剂量[2.5 μl/（只·次·侧）]、低剂量组[1.25 μl/（只·次·侧）]，每组各10只，雌雄各半。

1.5.2 鼻腔黏膜损伤小鼠模型制备 模型组与各给药组小鼠，用70℃蒸馏水50 μl×30次（每分钟1次）滴在双鼻中隔黏膜制备模型。

1.5.3 滴鼻给药 滴通鼻炎水阳性对照组给予滴通鼻炎水混悬液，十三味辛夷滴鼻剂高、中、低剂量组分别给予相应剂量的十三味辛夷滴鼻剂混悬液，头部斜下方20°滴入鼻腔两侧，停留30 s，2次/d，连续7 d。

1.5.4 鼻黏膜红肿观察与分级评定 滴鼻7 d后，通过肉眼观察小鼠鼻中隔黏膜（包含软骨部分）的红肿状况，依据“局部黏膜刺激反应分级标准”进行分级评分[4]。0度：未观察到任何损伤迹象，鼻黏膜无肿胀、淤血现象，记为0分。1度：发现轻微损伤，鼻黏膜出现肿胀，但未伴随淤血，记为1分。2度：损伤程度中等，鼻黏膜既肿胀又出现淤血，记为2分。

1.5.5 鼻黏膜组织病理学观察 滴鼻7 d后，检取小鼠鼻中隔黏膜（包括软骨部分）。将组织在10%的福尔马林溶液中固定12 h，之后转移到10%EDTA脱钙液中脱钙72 h。按照常规的病理学制片流程，对样本进行脱水、包埋和切片处理。进行苏木素-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色后，光镜下观察小鼠鼻黏膜的组织结构的改变。

1.5.6 鼻黏膜上皮细胞紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-1、Occludin的免疫组化检测 采用免疫组化技术检测鼻黏膜上皮细胞紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-1、Occludin的表达水平，具体步骤如下。①抗原修复：将石蜡切片脱蜡后放入0.01 M枸橼酸钠缓冲溶液（pH 6.0）中，通过微波炉加热进行抗原修复，自然冷却至室温。②阻断内源性过氧化物酶：在切片上滴加内源性过氧化物酶封闭液，室温孵育10 min以阻断内源性过氧化物酶。用PBS缓冲溶液洗涤样本3次，每次3 min。③封闭非特异性抗原：在切片上滴加正常山羊血清工作液，室温封闭10 min。④一抗孵育：用吸水纸吸去封闭液，加入足量的一抗工作液（ZO-1：1∶250，Claudin-1：1∶200，Occludin：1∶400），放入湿盒中，4℃孵育过夜。用PBS缓冲溶液洗涤样本3次，每次3 min。⑤二抗孵育：切片上滴加二抗工作液，室温孵育20 min。用PBS缓冲溶液洗涤样本3次，每次3 min。⑥链霉亲和素孵育：切片上滴加HRP标记的链霉亲和素溶液，室温孵育20 min。用PBS缓冲溶液洗涤样本3次，每次3 min。⑦显色反应：滴加DAB工作液显色5～10 min，显微镜下控制显色程度。⑧复染和封片：切片充分水洗后，用苏木素进行复染20 s，用1%盐酸分化10 s，用1%氨水返蓝10 s。然后进行梯度酒精脱水、透明和中性树胶封片。同时进行空白对照实验。⑨结果分析：在光学显微镜20×10倍下随机采集5个视野的图像，使用Image J 1.52a软件计算每张切片的平均光密度值。

1.6 统计学处理

使用GraphPad Prism 7.0软件对数据进行统计分析，数据经过正态化处理后，采用均值±标准差（）表示，统计学方法选择单因素方差分析（ANOVA），并结合Dunnett-t检验，P＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 十三味辛夷滴鼻剂对小鼠鼻黏膜损伤红肿程度的影响

模型对照组鼻黏膜红肿程度评分高于空白对照组（P＜ 0.05）；与模型对照组比较，滴通鼻炎水阳性对照组、十三味辛夷滴鼻剂高、中、低剂量组评分均降低，且随剂量增高，呈降低趋势。见表1。

表1 十三味辛夷滴鼻剂对小鼠鼻黏膜损伤红肿程度的影响（n=10，±s）

表1 十三味辛夷滴鼻剂对小鼠鼻黏膜损伤红肿程度的影响（n=10，±s）

组别红肿评分（分）空白对照组 0.707±0.025a模型对照组0.781±0.064滴通鼻炎水阳性对照组0.739±0.042十三味辛夷滴鼻剂高剂量组0.737±0.053十三味辛夷滴鼻剂中剂量组0.753±0.051十三味辛夷滴鼻剂低剂量组0.768±0.054

注 与模型对照组比较，aP ＜ 0.05

2.2 十三味辛夷滴鼻剂对小鼠鼻黏膜组织病理结构的影响

空白对照组中，小鼠鼻黏膜上皮细胞呈现规则的假复层柱状排列，可见正常的杯状细胞，固有层毛细血管、分泌腺结构清晰。模型对照组中，小鼠的鼻黏膜呈现出明显的增厚和结构紊乱：上皮细胞出现剥脱，杯状细胞肥大，基底膜层受到破坏，固有层间质出现水肿，毛细血管扩张明显，腺体和腺管也出现肥大和扩张，炎症细胞大量浸润。与模型对照组比较，滴通鼻炎水阳性对照组组织结构明显改善；十三味辛夷滴鼻剂高、中、低剂量组呈现不同程度改善，随剂量增高，组织结构明显好转。见图1。

图1 十三味辛夷滴鼻剂对小鼠鼻黏膜损伤组织病理学的影响（HE染色，200×）

2.3 十三味辛夷滴鼻剂对小鼠鼻黏膜上皮细胞ZO-1、Claudin-1、Occludin表达的影响

与模型对照组比较，空白对照组、滴通鼻炎水阳性对照组及十三味辛夷滴鼻剂高、中、低剂量组ZO-1蛋白表达量增高，差异有统计学意义（P＜ 0.05）。与模型对照组比较，空白对照组、滴通鼻炎水阳性对照组、十三味辛夷滴鼻剂高剂量组Claudin-1蛋白表达量显著增高（P＜ 0.05）；十三味辛夷滴鼻剂中、低剂量组的Claudin-1蛋白表达量无显著改变（P＞ 0.05）。与模型对照组比较，空白对照组、滴通鼻炎水阳性对照组、十三味辛夷滴鼻剂高、中剂量组Occludin蛋白表达量显著增高（P＜ 0.05）；十三味辛夷滴鼻剂低剂量组Occludin蛋白表达量无显著改变（P＞ 0.05）。见表2、图2。

图2 十三味辛夷滴鼻剂对小鼠鼻黏膜上皮细胞ZO-1、Claudin-1、Occludin表达的影响（免疫组化，200×）

表2 十三味辛夷滴鼻剂对小鼠鼻黏膜上皮细胞ZO-1、Claudin-1、Occludin表达的影响（n=10，±s）

表2 十三味辛夷滴鼻剂对小鼠鼻黏膜上皮细胞ZO-1、Claudin-1、Occludin表达的影响（n=10，±s）

组别ZO-1Claudin-1Occludin空白对照组0.286±0.008a0.282±0.010a0.254±0.010a模型对照组0.220±0.0090.237±0.0140.230±0.014滴通鼻炎水阳性对照组0.296±0.011a0.297±0.044a0.267±0.002a十三味辛夷滴鼻剂高剂量组0.291±0.025a0.280±0.016a0.264±0.004a十三味辛夷滴鼻剂中剂量组0.258±0.019a0.256±0.0120.256±0.005a十三味辛夷滴鼻剂低剂量组0.272±0.019a0.252±0.0200.242±0.005

注 与模型对照组比较，aP ＜ 0.05

3 讨论

十三味辛夷滴鼻剂由苍耳子、辛夷、白芷、细辛、荜茇、当归、鱼腥草、荆芥、沙棘、鹅不食草、人工麝香、薄荷脑、冰片等药味组成，是广泛用于临床治疗各种鼻炎、鼻窦炎的外用纯中药复方制剂，表现出显著的“修”（修复鼻腔黏膜损伤）和“排”（促进浓涕排出）的作用。方中苍耳子、辛夷为君药，散风寒、通鼻窍；白芷、细辛、鹅不食草为臣药，祛风散寒、通窍止痛；佐以麝香、薄荷脑芳香走窜，并以冰片、鱼腥草清热解毒、消炎止痛，制君药之辛温太过；当归、荆芥穗活血补血、疏风止痛。本品辛温散寒、通窍止痛、消炎解毒，具有良好的抗病毒、抗菌消炎、镇痛、调节免疫功能、黏膜修复的药理作用。

针对物理诱因制备鼻黏膜损伤模型的实验研究发现，艾烟环境、辐照、低氧、光动力疗法、PM2.5等会引起鼻黏膜组织病理结构改变，诱发黏膜上皮屏障损伤和炎性反应[5-9]；此外，用50℃或70℃的生理盐水滴鼻30次（每分钟1次）刺激大鼠鼻中隔黏膜，均可引起黏膜组织病理结构改变；50℃滴鼻组15 d后可自行恢复，但70℃滴鼻组第28天仅可见少数恢复[10]。

紧密连接（tight junctions，TJs）、黏附连接、桥粒及缝隙连接是鼻黏膜上皮细胞间的主要连接方式[11]。其中，TJs是一种大分子复合物，由跨膜蛋白Occludin、Claudin、胞质附着蛋白ZO家族、JAMs以及细胞骨架蛋白等构成连续的带状结构，围绕着上皮或内皮细胞的顶端将相邻细胞连接在一起，形成表皮渗透屏障、维持屏障功能[12-13]。Occludin是第一种被发现的紧密连接跨膜蛋白，参与调控旁细胞通透性及维持细胞极性[14]。在糖化终产物受体（receptor for advanced glucation end products，RAGE）和其配体高迁移率族蛋白B1（high mobility group protein box-1，HMGB1）导致的气道上皮细胞屏障功能损伤中，Occludin发挥重要作用，对RAGE和HMGB1的抑制能显著提高Occludin等蛋白的表达，维持气道上皮的完整性[15]。细胞中高浓度的蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）会使Occludin蛋白去磷酸化，降低跨膜电阻值（trans-epithelium electrical resistant，TER），进而降低细胞极性和细胞间通透性[16]。Claudin蛋白家族的27个成员广泛分布于各种上皮和内皮细胞之间。Claudin-1是一种在各种上皮组织中广泛表达的蛋白，是机体旁细胞屏障中最重要的TJs蛋白。有研究显示，当小鼠的Claudin-1基因被敲除时，它们出现了电解质和水分的大量流失，仅能存活1天[17]。此外，胞浆蛋白ZO-1在TJs的组装和信号转导中起到关键作用。当ZO-1基因的表达被降低时，会导致肌动蛋白和肌球蛋白的结构变化，从而降低MDCK单层细胞的TER值，并增加示踪分子的透过率[18]。

前期研究中，本课题组参考文献[9]，基于模型制备的可操作性与黏膜损伤持续的时间，探索建立了一种制备小鼠鼻黏膜热损伤模型的方法：具体操作是将50 μl 70℃的蒸馏水对小鼠双鼻中隔黏膜进行30次滴注，每次滴注间隔1 min。经十三味辛夷滴鼻剂高剂量滴鼻治疗7 d后，由热刺激导致的鼻黏膜损伤红肿程度明显减轻，鼻黏膜表皮完整性、上皮细胞水肿程度、杯状细胞肥大、间质炎细胞浸润、黏膜厚度等明显改善，且能明显上调ZO-1、Claudin-1、Occludin蛋白表达。本研究结果证实十三味辛夷滴鼻剂可能通过上调鼻黏膜上皮细胞紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-1、Occludin表达，修复鼻腔黏膜保护屏障、维持细胞极性，防御病原微生物入侵，减轻炎性反应，达到消炎解毒、通窍止痛的功效。