C57-ras致癌性转基因小鼠模型的脏器及血液学参数

左 琴，李 波，岳秉飞，范昌发

（中国药品生物制品检定所实验动物中心，北京 100050）

实验动物的血液生理生化、脏器重量和脏器系数等特性参数，是现代实验动物科学的一项重要内容，是探讨疾病发生机制、生理学、药理学、毒理学等实验研究的重要参考值。动物的血液生理生化、脏器和脏器系数等参数不仅受其年龄，性别、生理状态、生活环境和营养水平的影响，也受动物的种类、品系、遗传背景的影响［1］。对于这些参数的测定，已经开展了大量的工作［2-5］。这些工作促进了动物品系，特别是新模型动物的推广和使用。

本文所研究的模型动物为C57-ras，是作者单位通过转基因的方法，将人原癌基因C-Ha-ras（简称ras基因）导入C57小鼠基因组中而自主建立（专利公开号：CN 101532018A）。该模型将主要用于药物临床前安全性评价、抗癌药物的筛选等领域，以部分替代传统的耗时长、费用高的2年期大小鼠致癌性评价方法［6］。本实验背景数据的获得，将为该模型的在致癌性安全评价中的使用提供支持，同时也丰富了国家啮齿类实验动物种子中心的背景数据库，可更好的为公众服务。

1 材料和方法

1.1 实验动物及分组

从人基因组中分离获得人原癌基因c-Ha-ras，经纯化处理，显微注射受精卵细胞，经移植产仔筛选，获得6只C57-ras首建鼠。将首建鼠与健康普通C57小鼠交配建系传代动物，有3只成功建系［SCXK（京）2005-0004］。本次实验所用动物为F5-6代，饲养于本单位实验动物资源中心的清洁级环境，饲喂SPF小鼠颗粒饲料，饮用自来水。

通过PCR方法检测筛选动物。引物设计针对转基因的编码序列，序列为：上游引物为Pri.PFT：5’-acacgggccgtagctgagtcgagagct-3’，下游引物为Pri.PRN1735：ctgcggtcagcagcctcccttgtgcc。PCR体系按常规方法建立。

分组：分为ras阴性雌鼠（ras-）、ras阴性雄鼠（ras-）、ras阳性雌鼠（ras+）、ras阳性雄鼠（ras+）等4组，各组5只动物。

1.2 测试仪器及试剂

日本光电MEK 27222K血球分析仪测定血液生理指标，仪器精度：WBC 210％，RBC 115％，HGB 115％，MCV 110％，PLT 410％。分析试剂是溶血剂ⅠDH680，批号20091207；溶血剂ⅡDH910，批号20091201。

OlympusAU400全自动生化分析仪测定血液生化指标，所用生化试剂批号090381.200911，生产公司是中生北控生物科技股份有限公司。

sartorius BS110S电子天平测定脏器重量，精度是0.1mg，德国塞多利斯公司生产。

1.3 采血方法

空腹12h，活体称重后，眼眶静脉丛采血，用于血液生理指标的测定。摘眼球采血，用于血液生化指标的测定，最后小鼠颈椎脱臼处死后解剖。

1.4 血液生理指标测定项目及方法［7］

红细胞计数（RBC）、血红蛋白浓度（HGB）、红细胞压积（HCT）、平均红细胞体积（MCV）、平均红细胞血红蛋白（MCH）、平均红细胞血红蛋白浓度（MCHC）、红细胞分布宽度（RDW）、白细胞计数（WBC）、白细胞分类计数、血小板计数（PLT）、平均血小板体积（MPV）、血小板压积（PCT）和血小板分布宽度（PDW），共22项。

1.5 血液生化指标测定项目及方法［7］

丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、碱性磷酸酶（ALP）、尿素（BUN）、肌酐（CREA）、葡萄糖（GLU）、钙（CA）、磷（P）、总胆固醇（CHO）和甘油三酯（TG）。

1.6 脏器指标测定［8］

分离心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、胸腺、子宫、睾丸，用生理盐水清洗血污，吸水纸吸干表面水分，剔除脏器表面脂肪、筋膜后用电子天平称重，精确到0.0001g。脏器重量以g为单位，脏器系数以脏器重量/体重×100％表示。

1.7 数据处理

用Excel统计实验所得数据的均值和方差，进行t检验数据处理，统计结果以平均值±标准差表示。

2 结果

经提取DNA，两次重复PCR，电泳检测等实验对动物进行检测。两次重复，均为阳性的判为阳性结果，均为阴性的判为阴性；如果存在结果不一致的情况，重复第三次。将转基因阳性（ras+）和阴性的（ras-）小鼠随机分组，进行检测。通过检测和筛选，获得了20只转基因阳性和阴性动物，用于各种参数测定。

2.1 血液生理学指标测定结果

测定了22项血液生理学指标，详见表1［7］。ras-雌鼠和ras+雌鼠比较，嗜中性粒细胞（NEUT）、嗜中性粒细胞百分比（NEUT％）差异显著（P＜0.05），血小板压积（PCT）差异极显著（P＜0.01）；其余19项无显著性差异（P＞0.05）。

表1 C57-ras转基因小鼠和非转基因小鼠的血液生理参数Tab.1 Blood physiological values of C57-ras transgenic and non-transgenic mice

ras-雄鼠和ras+雄鼠比较，红细胞数（RBC）、红细胞压积（HCT）、血小板数（PLT）、血小板压积（PCT）差异显著（P＜0.05），单核细胞百分比（MON％）差异极显著（P＜0.01）；其余17项无显著性差异（P＞0.05）。

2.2 血液生化指标测定结果

共测定了12项血液生化指标，详见表2［7］。ras-雌鼠和ras+雌鼠比较，12项生化指标均差异不显著（P＞0.05）。ras-雄鼠和ras+雄鼠比较，丙氨酸氨基转移酶（ALT）、甘油三酯（TG）差异显著（P＜0.05），其余10项差异不显著（P＞0.05）。

表2 C57-ras转基因小鼠和非转基因小鼠的血液生化参数值Tab.2 Serum biochemical values of C57-ras transgenic mice and non-transgenic mice

2.3 脏器重量和脏器系数比较

ras-雌鼠和ras+雌鼠、ras-雄鼠和ras+雄鼠的体重分别是19.46±0.65g和20.31±4.05g、26.66±2.69g和26.17±1.21g，其主要脏器重量及系数见表3［4］。ras-雌鼠和ras+雌鼠比较，肺重量差异极显著（P＜0.01），其余7个脏器重量及系数均差异不显著（P＞0.05）。ras-雄鼠和ras+雄鼠比较，8个主要脏器的重量和系数均差异不显著（P＞0.05）。

3 讨论

3.1 C57-ras模型在安全评价中应用

根据欧洲经济合作与发展组织指导原则（OECD TG 451）规定，传统的致癌性评价方法是通过2年期大、小鼠致癌性实验完成的［6］。这类实验动物用量大、人力和资金成本高、耗时长，受到背景肿瘤的严重干扰，结果准确性差［9］。转基因或基因敲除的遗传修饰动物模型的建立，较好的解决了上述问题。在国外，致癌性模型动物已经实现模型动物商品化供应。C57-ras致癌性模型的建立，有望弥补我国新药评价技术体系中部分缺憾。

表3 C57-ras转基因小鼠和非转基因小鼠的脏器重量及系数比较Tab.3 Comparison of organ weight and coefficient between C57-ras transgenic mice and non-transgenic mice

3.2 部分血液生理生化参数存在差异

血液生理生化值反映了动物的新陈代谢及生理机能状况，是衡量动物健康标准及遗传稳定的指标，也是临床疾病诊断的重要依据。本次实验结果显示，组间部分血液、生化参数存在在差异。如ras+和ras-的NEUT、PCT和RBC之间存在差异；生化参数ALT和TG存在显著差异。由于所有动物均在相同条件下饲养，周龄相同；二者差别体现在是否含有转基因上，即遗传背景不同。可以推测，该差异可能是由于转基因的插入，引起动物部分生理生化指标改变。

3.3 脏器重量和脏器系数几乎无差异

脏器重量及脏器系数是衡量动物功能状态的重要指标，也是药物进行毒性实验的指定检测项目［11］。从表3可知，ras-雌鼠和ras+雌鼠进行比较，肺重量有极显著性差异（P＜0.01），其余7个脏器重量及系数均差异不显著（P＞0.05）。对ras-雄鼠和ras+雄鼠进行比较，8个主要脏器的重量和系数均差异不显著（P＞0.05）。这进一步证实了rasH2转基因小鼠和其对照的正常小鼠在其一致的时期主要生物学特性较为一致。

总体而言，转基因阳性动物和同窝转基因阴性动物相比较，其血液生理生化、脏器和脏器系数相差不大。这对该模型将来在临床前安全评价中应用将是有利的。

［1］孙靖.实验动物学基础［M］.北京：北京科学技术出版社，2005：601.

［2］战大伟，王冬平，栾蓉晖，等.Smad3基因剔除小鼠的血液生理生化指标检测-70日龄Smad3小鼠［J］.实验动物科学与管理，2002，19（1）：7-101.

［3］栾蓉晖，王冬平，李吉庆，等.Smad3基因剔除小鼠的血液生理生化指标检测-35日龄Smad3基因剔除小鼠［J］.实验动物科学与管理，2002，19（2）：11-14.

［4］戴丽军，叶炳飞，黄月铃.Fmr1基因敲除小鼠的脏器重量和脏器系数的比较分析［J］.中国比较医学杂志，2009，19（6）：59-61.

［5］田小芸，恽时锋，胡玉红，等.基因工程ROSA小鼠主要脏器重量及脏器系数的测定［J］.实验动物科学，2009，26（2）：1-3.

［6］OECD guidelines for the testing of chemicals.Test No.451：Carcinogenicity Studies［R/OL］.http://www.oecd.org/dataoecd/30/46/41753121.pdf

［7］王洪，张华琼，黄麟，等.雌雄金黄地鼠血液生理生化指标的比较分析［J］.中国比较医学杂志，2008，18（2）：36-42.

［8］詹纯列，李权超，徐本法，等.SPF小型猪主要脏器重量脏器系数的测定［J］.中国实验动物学杂志，2001，11（4）：215-217.

［9］David JK，Frank S，Abigail J.Use of transgenic mice in carcinogenicity hazard assessment［J］.Toxicol Pathol，2004，32（Sup.1）：49-52.

［10］恽时锋，胡玉红，田小芸.不同品种实验兔主要脏器重量及脏器系数的研究［J］.中国比较医学杂志，2004，14（6）：350-354.