埃博拉出血热动物模型研究进展

许黎黎，秦 川

（中国医学科学院实验动物研究所，北京协和医学院比较医学中心，北京 100021）

埃博拉出血热（Ebola hemorrhagic fever，EHF）是由埃博拉病毒（Ebola virus，EBOV）引起的一种急性出血性传染病，于20世纪70年代在非洲首次发现［1］，具有极高的传染性，其致死率高达50％～88％［2］。由于其在自然界的宿主尚未查明，且暂无有效的抗病毒药物和疫苗，目前对该病的预防还极为困难。世界卫生组织已将EBOV列为对人类危害最严重的4级病毒，因此，构建埃博拉出血热的动物模型，对于病毒致病机理的了解和深入研究，以及治疗药物及疫苗的研发具有至关重要的作用。

1 埃博拉出血热的血清型、临床表现及病理改变

EBOV包括四种亚型：埃博拉-扎伊尔（Ebola-Zaire，ZEBOV），埃博拉-苏丹（Ebola-Sudan，SEBOV），埃博拉-科特迪瓦（Ebola-Cote d’Ivoire，CEBOV）和埃博拉-莱斯顿（Ebola-Reston，REBOV）。发生在刚果（前扎伊尔），苏丹和科特迪瓦的三种亚型埃博拉病毒已被证实能够致人类疾病。不同亚型毒力不同，ZEBOV毒力最强，人感染死亡率高达88％；SEBOV次之，致死率约为50％；CEBOV对黑猩猩有致死性，对人的毒力较弱，致病但不致死；REBOV对非人灵长类有致死性，人感染不发病［3］。

埃博拉出血热潜伏期约2～21d，起病急。最初的临床表现为发热、畏寒、头痛、肌痛及恶心。随后出现严重的腹痛、呕吐和腹泻。部分病例于发病5～7d出现斑疹，以肩部、手心和脚掌多见。许多病例出现结膜充血和黑便等症状。重症病例皮肤黏膜和内脏均可出血，以呼吸道和肠道最为严重。通常死亡病例均发生出血症状，推测与弥漫性血管内凝血有关。

病人感染后主要的病理改变是皮肤，黏膜，脏器的出血，在很多器官可以见到灶性坏死，但是以肝脏、淋巴组织最为严重。肝细胞点，灶样坏死是本病最显著的特点，可见小包涵体和凋亡小体。

2 动物模型研究进展

2.1 小鼠模型

免疫系统完整的成熟小鼠不能感染EBOV，推测可能是由于其强大的先天免疫系统，尤其是IFN-Ⅰ型反应所导致［4］。腹腔或脑内接种病毒可对乳鼠产生致死效应［5］，推测是由于IFN-Ⅰ型免疫反应系统发育不全所导致。成熟的免疫系统缺陷小鼠，如缺失功能性B细胞及T细胞的SCID小鼠也可被EBOV感染并致死。然而，不同于人类及其他动物模型，SCID小鼠被ZEBOV攻毒后可继续健康存活数周，然后再逐渐出现体重下降及活动减少等症状，20～25d后死亡［4］。缺失IFN-Ⅰ型免疫系统的小鼠，如IFN α/β受体或STAT基因敲除小鼠，也无一例外的于皮下攻毒一周内死亡［6，7］（表1及表2）。

表1 各种动物模型被野生型及传代适应株ZEBOV感染后的主要特征Tab.1 Main infection features of ZEBOV viruses in animal models and humans

表2 ZEBOV对小鼠的感染情况Tab.2 ZEBOV infection in mice

另一途径是通过将ZEBOV在免疫系统完整的小鼠体内连续传代，来获得小鼠适应株［8］（表1及表2）。感染这种小鼠适应型EBOV的小鼠于攻毒后3d发病，5～7d后死亡，死亡小鼠的肝及脾内均可检测到滴度高达109PFU/g的病毒［8］。同时，肝和脾发生的病理改变，以及血清中的转氨酶（天冬氨酸转氨酶，AST；丙氨酸转氨酶，ALT）水平，与被ZEBOV攻毒的灵长类动物模型的病理表征极为类似［6］。然而，与灵长类相反的是，小鼠组织中仅有少量的纤维蛋白沉淀，并且仅腹腔攻毒可致死小鼠，当使用其他攻毒途径时，即使加大攻毒剂量，小鼠仍能存活。

2.2 豚鼠模型

用ZEBOV攻毒豚鼠仅能引发短时的，非致死的发热症状［9］。同样，使用ZEBOV在近交及远交系豚鼠体内连续传代可获得使豚鼠致死的适应株［9］（表1）。该适应株攻毒豚鼠约5d后开始出现禁食、发热、脱水等临床症状，8～11d后无一例外的死亡，但并不伴随出血的现象［9］。肝和脾中可于攻毒后2d检测到病毒，3d时病毒扩散至肾、肾上腺、肺、及胰脏，随后组织平均病毒滴度逐步上升并于9d时达到峰值，病毒血症于7d时达到近105PFU/mL的峰值。感染的豚鼠同时还逐渐出现凝血时间（prothrombin time，PT）延长等现象［10］。

2.3 非人灵长类模型

很多非人灵长类（nonhuman primates，NHP）动物均被用于埃博拉动物模型的研究，包括非洲绿猴（Chlorocebus aethiops）［11-14］、狒狒（Papio hamadryas）［14-18］、恒河猴（Rhesus macaques）［11，19-22］、食蟹猴（Cynomolgus macaques）［12，15，23］。其中恒河猴和食蟹猴目前使用的最为广泛，均对EBOV高度敏感，可引起与人类极为类似的临床症状。食蟹猴对ZEBOV最敏感，临床症状出现最快，一般3～4d，濒死前发热持续时间短，约2～3d。而恒河猴临床症状出现时间要稍慢一些，但更接近于人类。攻毒后2d可检测到病毒血症的发生，并于2～3d后达到峰值。除此以外，狒狒对所有亚型EBOV均存在一定程度耐受，非洲绿猴对REBOV耐受［12，14，18］。值得一提的是，除了所使用动物模型的类型差异外，攻毒使用的毒株、剂量、及接种方式，均对模型最终所产生的临床症状、病情持续时间、及严重程度产生不可忽视的影响。

NHP动物模型被ZEBOV攻毒后濒死前体温会骤然下降，体重的减轻程度也会高于10％，推测是由于脱水，而非脂肪的分解，部分动物还会出现腹泻及间歇性黑粪症的现象。攻毒后4d时，NHPs皮肤上通常会出现斑丘疹并持续至死亡。发病早期会出现外周淋巴结肿大，中期及晚期可见肝脏肿大并出现圆形囊状边缘［24］。病毒血症通常于攻毒后2d可以被检测出来，并于2～3d后达到峰值。同时，所有被攻毒的NHPs均出现显著的血小板减少的症状，从攻毒后6d开始出现凝血时间延长的现象，至10～12d时血液失去凝集能力［22］。此外，血浆中的钠、钾、钙离子水平均呈下降趋势，而尿素和肌酸酐水平上升。从第5天开始，转氨酶（AST，ALT）水平持续升高，直至动物死亡［22，25，26］。

关于SEBOV感染NHPs来进行动物模型研究的报道较少，恒河猴和食蟹猴被SEBOV攻毒后临床症状较ZEBOV攻毒后出现的稍晚几天，而存活率要稍高一些［12，27］。

3 讨论

尽管啮齿类动物模型与人类疾病存在一定程度的相似性，但它们感染EBOV后与人类及NHPs在临床表征、组织病理等方面的显著性差异导致其使用的局限性［3，7，8，28］，一些非常重要的临床感染现象如体温升高、斑丘疹的出现、弥散性血管内凝血（DIC）等在啮齿类动物模型身上均无法体现［4，24］。与小鼠相比，豚鼠感染后可表现出相对而言更严重的凝血障碍，包括血小板数量减少、凝血时间延长等，但纤维蛋白的沉积及凝结程度仍远低于NHPs模型［10］。此外，小鼠及NHPs感染EBOV后出现的一项重要特征，淋巴细胞凋亡现象，在豚鼠模型中也并不明显［8，10，21］。尽管如此，在对新疫苗进行体内评估，或对新的治疗方案进行制定时，啮齿类动物模型仍然担当着不可替代的重要作用。尤其是小鼠，可以方便获得大量的近交系品种，或者各种不同品系的免疫缺陷型，以及各种基因改造小鼠。值得注意的是，当对基于啮齿类动物模型所做的研究进行评估时，绝不可随意推测其用于人类临床治疗的效果，已有大量报道指出很多抗EBOV的治疗药物及疫苗在啮齿类动物模型身上表现出极好的保护性作用，而一旦进入NHPs模型实验阶段，却显示无效［21，29-31］。研究者们推测这归因于啮齿类与人类及NHPs免疫系统的巨大差异［32］，尤其是啮齿类动物所特有的极强的先天免疫系统的差异所导致的［4］。

NHPs则是作为研究EBOV感染的优良动物模型，它们在临床表征、组织病理等方面都与人类极为类似。在选择一种合适的NHP模型时，动物的品种、性别、年龄，以及攻毒的途径、剂量，都必须列入重点挑选及考虑范围之内，因为这都是影响实验结果的关键因素［24］。食蟹猴和恒河猴被公认为是研究EBOV感染的“金标准”模型，其中恒河猴的优势更加明显，因其更加广泛的被用于制药行业，并且其全基因组序列已被公布［24，33］。然而，由于近年来新发传染性疾病的迅速增多，从而导致对NHPs需求的激增，以至于NHPs的供不应求及持续短缺［34］。基于此，一些新品种NHPs的开发，对于缓解目前的研究压力及未来应对各种突发疾病的准备，具有至关重要的意义。

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