N-甲基亚硝基脲诱导小鼠胸腺淋巴瘤TCR基因重排分析

黄榕芳，余英豪，李 博

（1.南京军区福州总医院病理科，福州 350025；2.南京军区福州总医院实验科，福州 350025）

自20世纪80年代末分子生物学技术被应用于淋巴瘤研究以来，分子生物学和分子细胞遗传学特征已成为非霍奇金淋巴瘤（non-hodgkin lymphoma，NHL）诊断和研究中不可缺少的部分［1］。PCR是目前最常用于检测人类T-NHL克隆性T细胞受体（T-cell receptor，TCR）重排的方法，技术上相对成熟［2，3］。采用N-甲基亚硝基脲（N-methyl-N-nitrosourea，MNU）腹腔分次注射的方法，本实验室成功诱导了67.5％（27/40）实验组小鼠产生胸腺淋巴瘤［4］。光学显微镜下胸腺结构破坏，代之以弥漫分布的中等大小的淋巴样肿瘤细胞。免疫组织化学瘤细胞表达CD3和TdT。形态学和免疫组织化学结果证实27例胸腺肿瘤均为T淋巴母细胞淋巴瘤［5］。本部分以TCRβ和TCRγ基因重排为分子标志，应用高灵敏度的巢式PCR技术，对MNU诱导的小鼠胸腺T细胞淋巴瘤形成过程中发生的单克隆性基因重排变化进行探究性检测，旨在组织病理和免疫分型的基础上进一步确定MNU诱导肿瘤是否属T细胞克隆性增生。

1 材料和方法

1.1 标本采取

选用6～8周龄SPF级C57BL/6小鼠52只［SCXK（沪）2003-0003］，随机分为实验组40只和对照组12只。实验组于第0、8周分次腹腔注射MNU诱导液（50mg/kg体重）；对照组腹腔注射等量生理盐水。第22周所有小鼠颈椎脱位法处死。采集实验组胸腺淋巴瘤组织8例和对照组胸腺组织4例，迅速放入液氮罐内，后置入-70℃冰箱冻存。

1.2 基因组DNA提取

使用Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0试剂盒（Takara公司），按说明书提取DNA，并用紫外分光光度仪和1.0％琼脂糖凝胶电泳检验提取DNA质量。

1.3 巢式PCR

1.3.1 引物设计：引物设计参照文献［6］（表1）。

表1 PCR扩增和测序引物Tab.1 Oligonucleotide sequences for primers used in PCR assays and DNA sequence analysis

1.3.2 PCR扩增：50μL反应体系，含10×Ex Taq Buffer 5μL、dNTP Mixture 0.2mmol、引物各0.02μmol、模板DNA 200ng、Ex Taq酶2.5U（Takara公司）。经30个循环，循环开始前95℃预变性4min，循环结束后72℃延伸10min，然后保持在10℃。每一循环由变性95℃/15s、退火/15s（表1）和延伸72℃/30s三相组成。第一轮以提取的基因组DNA为模板，选用外侧引物；第二轮以第一轮扩增产物为模板，选用内侧引物。每次扩增均设立无DNA模板的空白阴性对照。

1.3.3 PCR产物检测：取PCR扩增产物行1.5％琼脂糖凝胶（含溴化乙啶）电泳，紫外透射分析仪上判读结果。

1.3.4 结果判定标准：与标准DNA分子量（Fermentas公司）对照，出现1～2条清晰、不连续的电泳条带为TCR阳性。3条以上、涂抹状散发性条带（smear）或无特异性条带者为阴性。

1.4 PCR产物胶回收及测序

TCRγ PCR产物按常规在1.5％琼脂糖凝胶上进行电泳，用DNA胶回收试剂盒（上海生工生物工程技术服务有限公司），按说明书操作回收DNA，委托Invitrogen公司测定序列。

2 结果

2.1 巢式PCR扩增

8例胸腺淋巴瘤巢式PCR均显示TCRβ、TCRγ单克隆性重排，两步反应阳性结果均呈现单一特异性条带。TCRβ基因第一轮扩增产物大小约为331bp，第二轮扩增基因重排带位于190～242bp范围内。TCRγ基因第一轮扩增带片段大小约242～331bp，第二轮片段大小约190～242bp。对照组胸腺组织和空白阴性对照二次扩增均未出现特异性条带（图1～图4）。

2.2 DNA序列分析

TCRγ基因内侧引物的PCR产物片段正反向序列分析结果显示，8例TCRγ基因的PCR阳性标本（产物1至产物8）分别为199～207bp不等的尖锐单峰。8例均含TCRGV3S1/TCRGJ1基因连接区、TCRGV3S1及TCRGJ1序列。表2所示为PCR产物1至产物8的TCRGV3S1/TCRGJ1基因重排区域片段与TCRγ胚系基因序列比对结果，其中V、J连接区插入核苷酸序列0～7bp大小。

图1 TCRβ基因重排第一轮扩增结果Fig.1 The primary PCR reaction of TCRβ gene rearrangement

图2 TCRβ基因重排第二轮扩增结果Fig.2 The secondary PCR reaction of TCRβ gene rearrangement

3 讨论

2008年WHO造血与淋巴组织肿瘤分类的诊断标准强调，淋巴组织肿瘤应结合形态学、免疫表型、遗传学以及临床特点等信息界定每一种疾病实体［8，9］。目前，分子生物学技术已在 NHL的诊断应用上受到较为广泛的重视，为NHL的传统诊断方法（组织形态观察、免疫组织化学）提供了新的技术手段辅助诊断，是对传统诊断方法的重要补充。

图3 TCRγ基因重排第一轮扩增结果Fig.3 The primary PCR reaction of TCRγ gene rearrangement

图4 TCRγ基因重排第二轮扩增结果Fig.4 The secondary PCR reaction of TCRγ gene rearrangement

PCR技术是一种体外酶促合成特异性DNA片段的方法，其分析T-NHL基因重排的原理基于所用引物特异性结合TCR基因的V区和J区。TCR由分隔在胚系基因组染色体上的多个基因编码，只有当基因发生重排使分隔的V区与J区靠近时，才能得到有效扩增。正常生理状态下，胸腺组织T淋巴细胞发育过程中，TCR基因结构不断发生随机重排，而且V-（D）-J结合区域随机插入不同数量的碱基形成完整的基因，故使每个T淋巴细胞均具有特异的结构基因，呈多克隆性。其PCR扩增产物片段长短不一，基因序列不同，电泳后表现为染色均匀的弥漫带（smear）或弥漫片状多克隆背景上相对较强的单克隆条带。胸腺T细胞淋巴瘤则为T淋巴细胞某个分化阶段发生突变的恶性克隆性增殖所致，瘤细胞为同一基因结构，属于单克隆性。经PCR扩增后，电泳呈一窄带。这就是PCR检测TCR基因重排的分子生物学基础。本研究对Lista等［6］的研究方法作了相应改进，选用单纯的巢式PCR扩增和电泳技术鉴定小鼠淋巴瘤的克隆性质。实验过程采用两组不同的V区引物和J区引物进行两步反应，一方面提高了灵敏度和检出率，另一方面也增加了反应的特异性。

表2 TCRγ基因重排V-J结合区DNA序列Tab.2 DNA sequence of TCRγ rearrangement VJ junctions

用PCR方法分析淋巴增生性疾病的TCR基因重排的研究，以前主要集中在TCRβ基因的V、D、J片段上。由于小鼠TCRβ链（6号染色体）V区片段众多，有20个基因片段［10］，通用引物可能降低检测的阳性率，家族特异性引物因引物数量太多而操作复杂。本研究引用的TCRBV5S1/TCRBJ2引物仅覆盖1个V区基因片段，可能仅能识别胸腺组织的小部分TCRBVJ重排［6］。然而，位于13号染色体上的TCRγ基因重排发生在T细胞分化的早期，参与重排的片段数量相对有限，仅含有7个V区、4个J区和4个C区基因片段［11］，其引物可能扩增出TCRγ基因所有V-J重排。另据报道，人类基因水平的TCRγ V-J基因重排出现在几乎所有的T细胞淋巴瘤及T淋巴细胞中［12］。基于以上考虑，我们联合选用针对TCRβ和TCRγ的巢式引物，以增强特异性，提高检出率。

本实验使用的模板DNA来自实验动物体内的原发性肿瘤，而非经过培养的细胞系，故能真实反映淋巴瘤在体内的恶性转化过程。研究结果显示，在确诊的8例胸腺淋巴瘤中全部检出TCRβ和TCRγ克隆性基因重排，阳性率均为100％。二者第二轮扩增带片段大小近似，均位于190～242bp范围内。4例对照组胸腺组织DNA中无一例出现阳性条带。不同处理组检出阳性率差异有显著意义，说明TCRβ和TCRγ基因重排在小鼠胸腺T细胞淋巴瘤中具有很高的发生频率，对其克隆性和细胞源性的确定有重要价值。实验中未出现假阳性或假阴性结果，分析主要原因是巢式PCR方法的高度特异性；另一方面加样量、PCR反应条件、电泳条件等各项实验条件的优化，也可能有效避免了假阳性或假阴性结果的出现。

送检的8例TCRγ重排PCR产物均得到了测序结果。将测序结果与TCRγ胚系基因［6，7］作比较，分别得出TCRGV3S1/TCRGJ1基因连接区、TCRGV3S1及TCRGJ1序列，验证了扩增产物即为TCRγ基因V区与J区的克隆性重排片段。8例基因重排连接区为0～7bp大小不等片段。片段大小的差异，考虑与每一例13号染色体上V区和J区的断裂点不同和所插入的N-区域核苷酸序列的多少有关［13］，这同时也解释了8例DNA序列并不完全相同的原因。虽然我们未对第一轮扩增产物作DNA序列测定，但第二轮反应产物片段（190～242bp）略小于第一轮（242～331bp）符合理论推算，也间接说明了结果的可靠性。

本研究有力说明了所使用的TCRβ、TCRγ基因巢式引物对胸腺T细胞淋巴瘤的克隆性和细胞源性的确定是相当敏感而特异的，结合形态学和免疫组织化学结果［5］，再次证实MNU诱导的小鼠胸腺淋巴瘤的形成过程实际上是单个T淋巴细胞TCR基因重排后，在MNU的作用下发生恶性转化，并单克隆性增生，最终取代胸腺内正常细胞，是属于T细胞来源的肿瘤。

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