中药银杏叶对老年痴呆症小鼠学习记忆能力的影响

谢超敏，郑桂兰，钟志勇，饶子亮，邝少松，王 刚，严家荣，陈系古

（广东省医学实验动物中心，佛山 528248）

老年痴呆症又称阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是主要发生在老年期的一种大脑神经细胞退行性变脑病，表现为持续性高级神经功能活动障碍，即在没有意识障碍的状态下，记忆、思维、分析判断、视空间辨认、情绪等方面的障碍。有资料表明，5％～15％的老年人有不同程度的痴呆症状。随着我国逐步进入老龄社会，老龄化趋势将使老年性痴呆患者数量增多，发病率逐年增高。由于AD的隐匿性和不可逆性，给家庭和社会带来很大负担。目前AD尚未有理想的治疗方法，而随着中医药的深入研究，也许能从中国的医药宝库中挖掘新的治疗方案，本实验在制作AD模型小鼠的基础上，比较中药银杏叶与西药脑复康片对动物模型记忆能力恢复的影响作用，现将相关指标分析如下。

1 材料和方法

1.1 动物来源

80只SPF级KM小鼠，18～22g，雌雄各半，由广东省医学实验动物中心提供［SYXK（粤）2008-0002］。

1.2 饲养环境

屏障系统。温度20℃～25℃，相对湿度40％～70％，光照周期为12h∶12h，换气次数（15～20）次/h。所用饮水、垫料均经121℃，30min高压蒸汽灭菌，全价颗粒饲料经121℃，30min高压蒸汽灭菌，饮用水为净化水，均由广东省医学实验动物中心提供。水和饲料自由饮食。

1.3 主要实验仪器及试剂

1.3.1 主要实验仪器：YP3001N电子天平（上海精密科学仪器有限公司）。荧光成像系统显微镜（奥林巴斯，型号：BX41）。紫外-可见分光光度计（上海尤尼柯公司产品，型号：UV-2800）。跳台仪（山东省医学科学院设备站，型号：YLS-3T）。

1.3.2 药物及主要试剂：银杏叶片，浙江某制药股份有限公司，批号：070801。吡拉西坦片（脑复康），广东某药业有限公司，批号：060903。D-半乳糖：广州威佳科技有限公司分装。三氯化铝：天津市福晨化学试剂厂，批号：20071102。乙酰胆碱酯酶、过氧化脂质（MDA）、超氧化岐化酶（SOD）、Na+、K+-ATPase、游离钙离子，南京建成生物工程研究所，批号：20090108。

1.4 实验方法

1.4.1 动物分组及实验设计：将80只SPF级KM小鼠根据体重随机分为4组：对照组、模型组、脑复康组、银杏叶组，每组20只。除对照组腹腔注射等量的生理盐水和灌胃等量的双蒸水外，其余各组腹腔注射D-半乳糖60mg/（kg·d）（生理盐水配制）和灌胃AlCl35mg/（kg·d）（双蒸水配置），每天1次，连续60d。脑复康组和银杏叶组自造模起上午给予AlCl3和D-半乳糖外，每日下午给予相应的药物，每日1次，连续60d，灌胃体积是0.2mL/10g。

1.4.2 指标测定

1.4.2.1 小鼠跳台试验：学习记忆获得性障碍实验：末次给药1h后开始训练。将动物放入反应箱内（台上、台下）适应环境3min，然后将动物放置反应箱内的铜栅上，立即通以36V的交流电。动物受到电击，其正常反应是跳回平台上。训练一次后，将动物放在反应箱内的平台上，记录5min内各鼠跳下平台的错误次数和第一次跳下平台的潜伏期，以此作为学习成绩。小鼠巩固记忆障碍实验：24h后进行重测验，将小鼠放在平台上，记录各鼠第一次跳下平台的潜伏期、各鼠3min内电击次数何受电击的动物数总数，同时计算出现错误反应的动物的百分率（受电击的动物数占该组动物总数的百分率）。小鼠记忆再现障碍实验：停止训练5d后（包括第5天）可以在不同的时间进行一次或多次记忆消退实验。

1.4.2.2 脑内自由基代谢指标的测定：处死动物，取大脑，保存在冰冻下，用生理盐水洗去血液备用，并用滤纸吸干水分，在冰浴下用匀浆器匀浆，用生理盐水稀释称10％匀浆，离心（3500r/min）10min，取上清液测定脑中乙酰胆碱酯酶活性、过氧化脂质（MDA）含量、超氧化岐化酶（SOD）活性、Na+、K+-ATPase、游离钙离子含量。乙酰胆碱酯酶活性、过氧化脂质（MDA）含量、超氧化岐化酶（SOD）活性、Na+、K+-ATPase按试剂盒说明进行操作。游离钙离子含量，参照文献［1］所用方法进行测定。

1.4.2.3 脑神经元细胞计数：各组小鼠取脑组织，分离海马组织和大脑皮质，固定于10％甲醛磷酸缓冲液中，常规石蜡切片，切片厚度为5μm，进行苏木素-伊红（HE）染色。光镜下进行形态学检测，各切片观察5个视野，并进行海马锥体细胞、大脑皮质神经元细胞计数。

1.5 统计方法

实验所得数据采用SPSS11.0统计软件进行t检验分析。

2 结果

2.1 银杏叶对AD模型小鼠学习记忆获得性障碍、巩固记忆障碍、记忆再现障碍的影响

结果表明，在AD模型小鼠学习记忆获得性障碍、巩固记忆障碍、记忆再现障碍跳台实验中，与模型组比较，银杏叶能延长潜伏期（P＜0.05），减少小鼠错误次数（P＜0.05），与脑复康组比较则无明显差异（P＞0.05），提示银杏叶具有改善AD模型小鼠学习记忆能力的作用（表1）。

2.2 银杏叶对AD模型小鼠脑组织SOD活性、MDA含量、游离钙离子含量、乙酰胆碱酯酶活性及Na+、K+-ATPase的影响

结果显示，模型组小鼠脑组织中SOD活性下降，MDA升高，表明自由基增多，抗氧化作用减弱。银杏叶组小鼠脑组织中：SOD活性与模型组比较明显升高（P＜0.05）、与脑复康组比较无明显差异（P＞0.05），MDA含量与模型组小鼠比较显著性降低（P＜0.05）、与脑复康组比较无明显差异（P＞0.05），表明银杏叶有升高小鼠痴呆的抗氧化能力，降低氧自由基对机体的损害。银杏叶组小鼠脑组织中Ca2+的浓度与模型组比较明显降低（P＜0.01）、与脑复康组比较无明显差异（P＞0.05）；银杏叶组小鼠脑组织中乙酰胆碱酯酶活性与模型组比较，显著性降低（P＜0.01）、与脑复康组比较无明显差异（P＞0.05）。银杏叶组小鼠脑组织中Na+、K+-ATPase与模型组小鼠比较无明显差异（P＞0.05）、与脑复康组小鼠比较也无明显差异（P＞0.05）。数据表明银杏叶能保护脑缺氧损害，改善记忆功能（表2）。

2.3 银杏叶对AD模型小鼠大脑海马锥体细胞和大脑皮质神经元细胞计数结果

结果显示，银杏叶组小鼠大脑海马锥体细胞总数与模型组比较显著性升高（P＜0.01），与脑复康组比较无明显差异（P＞0.05）；银杏叶组小鼠大脑皮质神经元细胞总数与模型组小鼠和脑复康组小鼠比较均无明显差异（P＞0.05）（表3）。

表1 银杏叶对AD模型小鼠学习记忆获得性障碍、巩固记忆障碍、记忆再现障碍的影响（±s）Tab.1 Ginkgo biloba on learning and memory in Alzheimer’s disease mice acquired disorder，consolidating memory impairment，memory impairment reproduction（±s）

表1 银杏叶对AD模型小鼠学习记忆获得性障碍、巩固记忆障碍、记忆再现障碍的影响（±s）Tab.1 Ginkgo biloba on learning and memory in Alzheimer’s disease mice acquired disorder，consolidating memory impairment，memory impairment reproduction（±s）

注：与模型组比较，“*”P＜0.05，“**”P＜0.01；与脑复康组比较，“△”P＜0.05，“△△”P＜0.01。Note：Compared with model group，“*”P＜0.05，“**”P＜0.01；Compared with piracetam group，“△”P＜0.05，“△△”P＜0.01.

组别Group剂量（g/kg）Dose学习记忆获得性障碍Access to learning and memory disorders巩固记忆障碍The consolidation of memory impairment记忆再现障碍Memory representation disorder潜伏期（s）Latency 5min错误次数The number of errors in 5min潜伏期（s）Latency 5min错误次数The number of errors in 5min潜伏期（s）Latency 5min错误次数The number of errors in 5min对照组Control group —288±29 0.2±0.4 266±56 0.3±0.5 260±91 0.4±0.7模型组Model group — 147±135 1.9±1.7 123±125 1.9±1.8 150±101 2.1±1.7脑复康组Piracetam group 0.364 262±63* 0.3±0.5* 287±28** 0.2±0.4* 254±67* 0.4±0.5**银杏叶组Ginkgo biloba group 0.400 268±60* 0.4±0.7* 292±15** 0.3±0.5* 242±93* 0.4±0.7**

表2 银杏叶对AD模型小鼠脑组织SOD活性、MDA含量、游离钙离子含量、乙酰胆碱酯酶活性及Na+、K+-ATPase的影响（±s）Tab.2 Ginkgo biloba on the Alzheimer’s disease mice brain tissue SOD activity，MDA content，free calcium ion content，acetylcholinesterase activity and Na+，K+-ATPase of（±s）

表2 银杏叶对AD模型小鼠脑组织SOD活性、MDA含量、游离钙离子含量、乙酰胆碱酯酶活性及Na+、K+-ATPase的影响（±s）Tab.2 Ginkgo biloba on the Alzheimer’s disease mice brain tissue SOD activity，MDA content，free calcium ion content，acetylcholinesterase activity and Na+，K+-ATPase of（±s）

注：与模型组比较，“*”P＜0.05，“**”P＜0.01；与脑复康组比较，“△”P＜0.05，“△△”P＜0.01。Note：Compared with model group，“*”P＜0.05，“**”P＜0.01；Compared with piracetam group，“△”P＜0.05，“△△”P＜0.01.

组别Group剂量（g/kg）Dose SOD（U/mg）MDA（nmol/mg）Ca2+（nmol/g）T-chE（U/mg）Na+、K+-ATPase（μmolpi/mgprot·h）对照组Control group — 163.9±28.3 2.51±0.53 86.7±15.5 1.90±0.29 4.67±0.41模型组Model group — 99.2±22.3 2.98±0.98 118.0±26.4 2.43±0.20 4.37±0.51脑复康组Piracetam group 0.364 135.0±24.8* 2.51±0.31 60.7±5.6** 1.58±0.28** 4.65±0.76银杏叶组Ginkgo biloba group 0.400 133.7±20.6* 2.13±0.41* 61.2±10.7** 1.69±0.35**4.29±0.68

表3 银杏叶对AD模型小鼠大脑海马锥体细胞和大脑皮质神经元细胞计数结果（±s）Tab.3 Ginkgo biloba on the Alzheimer’s disease mice brain hippocampal pyramidal cells and neurons in the cerebral cortex cell count results（±s）

表3 银杏叶对AD模型小鼠大脑海马锥体细胞和大脑皮质神经元细胞计数结果（±s）Tab.3 Ginkgo biloba on the Alzheimer’s disease mice brain hippocampal pyramidal cells and neurons in the cerebral cortex cell count results（±s）

注：与模型组比较，“*”P＜0.05，“**”P＜0.01；与脑复康组比较，“△”P＜0.05，“△△”P＜0.01。Note：Compared with model group，“*”P＜0.05，“**”P＜0.01；Compared with piracetam group，“△”P＜0.05，“△△”P＜0.01.

组别Group剂量（g/kg）Dose 5个视野海马锥体细胞总数5 view the total number of hippocampal pyramidal cells 5个视野大脑皮质神经元细胞总数5 view the total number of cerebral cortical neurons对照组Control group —140.1±14.9 116.4±22.5模型组Model group — 113.0±14.3 116.6±14.2脑复康组Piracetam group 0.364 134.3±19.2* 122.7±14.9银杏叶组Ginkgo biloba group 0.400 143.2±24.1**126.4±12.2

3 讨论

银杏叶［2］的主要成分为醇与水提取物，两者均能明显改善脑神经损害。银杏叶提取物能提高脑胆碱能神经功能，增加脑血流量，提高缺血脑组织对葡萄糖的摄取量和代谢率；减少脑组织耗氧量，具有保护脑神经细胞膜以及抗血栓、抗氧化、抗过敏、提高免疫力等功能。其片剂具有很强的清除自由基和抗氧化作用，治疗脑供血不足引起的眩晕、头痛、记忆减迟、智力下降等症状。据现代临床研究，银杏叶对以阴性症状为主（如社会退缩，懒散，思维贫乏，呆滞等）的慢性精神分裂症有显著效果，对老年痴呆症也有一定的效果。本实验研究中药银杏叶对老年痴呆症小鼠学习记忆能力的影响，并与疗效显著的西药脑复康片进行比较，对实验小鼠行为学以及脑组织多项相关指标进行测定及探讨。

记忆障碍动物模型是评价药物的重要工具。本实验通过实验动物腹腔注射D-半乳糖（加速动物衰老程度）和灌胃AlCl3（进行铝中毒）造模，迅速有效制作出AD模型小鼠［3］。根据跳台实验中的相关数据显示，银杏叶能延长AD小鼠潜伏期和减少错误次数，表明中药银杏叶有一定改善记忆功能作用。

衰老的过程中，AD患者脑细胞产生的神经递质有缺损，而中枢神经系统的损伤则与脑组织物质和能量代谢异常所导致的大量自由基有关。过量的自由基可使生物膜脂质双层中的不饱和脂肪酸过氧化，从而形成脂质过氧化产物。过氧化脂质的代谢产物MDA进一步与磷脂酰乙醇胺和蛋白质交联，生成无活性的脂褐质，沉积于组织细胞，使DNA、RNA持续降低，破坏细胞膜结构，最后导致细胞无法维持正常代谢而死亡。而SOD能不断地清除多余的自由基，保证机体代谢平衡，进而维持机体功能正常。目前，人们还普遍认为单胺类神经递质与记忆功能密切相关，且与胆碱能神经系统交互作用。实验结果中银杏叶能升高老年痴呆症小鼠脑组织中SOD的活性，有效降低MDA的含量，促进乙酰胆碱的释放，增加脑内胆碱受体的密度，有效清楚脑内氧自由基，从而改善记忆功能，对脑组织内自由基代谢疗效显著［4，5］。

AD患者大脑的重要改变表现为脑普遍萎缩，以与高有序认识能力相关区域如海马及相应皮质部尤明显，脑室扩大，脑沟变宽，中枢神经区域神经元和神经突触明显减少或消失。神经节细胞广泛变性，出现收缩、空泡变性与脂质沉着。近年研究表明［6］，各种原因造成的细胞超载，钙稳态失衡，是造成细胞死亡最后的总通路。从实验脑细胞神经元计数结果表明，银杏叶能改善脑损伤程度，保护海马，从而促进学习和记忆，改善AD一些症状。

脑复康［7］为氨酪酸的同类物，具有激活、保护和修复脑细胞的作用，可加速大脑半球间经过胼胝体的信息传递速度，提高学习记忆及思维活动的能力。其不良反应表现为口干、恶心、呕吐、腹部不适、纳差；中枢神经系统兴奋、易激动、头晕、头痛和失眠等。经本实验验证了其对AD的显著治疗作用，而且与西药脑复康比较，疗效［8］相似，毒副作用少。

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