舒脑欣滴丸对偏头痛模型大鼠脑膜组织形态及脑干 c-fos基 因 mRN A 表达的影响*

杜 帅 张艳军 佟永领 刘丽华 刘俊静 天津中医药大学中药学院 (天津 300193)

舒脑欣滴丸由传统方剂“芎归汤”发展而来,成分为川芎和当归,具有理气活血,化瘀止痛的功效 ,临床上用于血虚血瘀引起的头痛、头晕、视物昏花、健忘、失眠及偏头痛等症状,疗效明显,但其治疗偏头痛的作用机制尚不明确,有待进一步研究。

1 实验材料 1.1 实验动物 健康雄性 SD大鼠,体重270±20 g,北京维通利华实验动物有限公司(合格证号 SCXK(京 )2008-0001)。

1.2 药物与试剂 硝酸甘油注射液(国药准字号:H11020289),西比灵(国药准字号:H10930003),正天丸 (国药准字号:Z44020711),舒脑欣滴丸,TRNzol总 RNA提取试剂盒、 RNase Free Water(RT121-01)、EB(RT203)(天根生化科技北京有限公司),PCR Kit(AMV)Ver.3.0(DRR019A)、琼脂糖 (D601)、6×Loading Buffer、 200dp Maker(D514A)、 DN A Ladder Maker(D514A)(宝生物工程大连有限公司),PCR反应引物β-actin、c-fos(上海生工生物工程技术服务有限公司 )。

1.3 仪 器 光学显微镜(Olympus),Du530核酸蛋白分析仪(Beckman),PE-480基因扩增仪(Hybaid),ECP3000型凝胶电泳仪、YY-155-94型电泳槽(北京六一厂),Gene Genius凝胶成像分析仪(Bio Image system Gene Company)。

2 实验方法 2.1 分组及给药 各实验动物随机分为正常组 ,模型组,舒脑组高、低剂量组,西比灵组,正天丸组。复制模型前每组灌胃给药 4d,给药剂量:舒脑欣高剂量组 90.72mg◦ kg-1,舒脑欣低剂量组 45.36mg◦ kg-1,西比灵 1mg◦kg-1,正天丸 1.62g◦ kg-1。正常组和模型组分别给予等量生理盐水。第 5d造模后 30min给药 1次。

2.2 偏头痛大鼠模型制备 采用 Cristina方法,皮下注射硝酸甘油注射 10mg◦ kg-1,复制实验性大鼠偏头痛模型。大鼠出现双耳发红,前肢频繁搔头,爬笼次数增多,烦躁不安等症状。

2.3 大鼠脑膜组织形态学观察 行为学评价后,用 10%水合氯醛(0.3mL◦ kg-1)腹腔注射麻醉,经左心室灌注固定,断头取部分系着脑膜的颅骨放入 4%多聚甲醛(4℃)中备用。脑膜HE染色,将脑膜从置于 4%多聚甲醛的颅骨上分离后,做常规石蜡切片。全部标本的 HE染色切片均由两名有经验的病理科医师在双盲情况下进行观察复核。

2.4 脑干内痛觉相关基因 c-fos检测 各组大鼠断头取脑,迅速分离脑干 ,将脑干放入 ep管内,标记后置于液氮内保存备用。RT-PCR方法检测样本目的基因 mRNA的表达,引物序列如下。目的基因:β-actin,引物序列:上游:AGAGGGAA ATCGTGC下游:CGAT AGTGATGACCT。目的基因:c-fos,引物序列:上游:ACGCGGACTACGAGGCGTCAT下游:CTTCGGAT TCTCCGT TTCTC。

3 结 果 3.1 大鼠行为观察 大鼠置于安静的实验场所适应环境,1h后开始复制偏头痛模型。除空白对照组外,其余动物造模后均出现双耳发红、前肢频繁挠头、爬笼次数增多,烦躁不安等现象。治疗组动物在给药后,上述现象逐渐消失,趋于正常。模型组动物上述现象持续约 3h,继而出现蜷卧,活动减少状态。

3.2 大鼠脑膜组织形态学观察 镜下观察毛细血管、组织结构变化,炎性细胞渗出(图 1-6)。正常组:可见正常的毛细血管,脑膜组织结构完整紧密,但发现部分扩张毛细血管周围存在淋巴细胞。模型组:可见毛细血管扩张,细胞间结构疏松,组织水肿,大量炎性细胞(以中性粒细胞为主)存在于血管内。舒脑欣高剂量组:血管扩张不明显,细胞间结构较疏松,轻度水肿。舒脑欣低剂量组:可见毛细血管扩张,血管周围组织轻度水肿,部分血管周围有炎性细胞(以中性粒细胞为主)渗出。正天丸组:可见毛细血管扩张,血管周围细胞间结构疏松,组织水肿,有炎性细胞(中性粒细胞和淋巴细胞 )渗出。西比灵组:可见毛细血管扩张明显,血管周围组织水肿,部分血管周围存在巨噬细胞。

表1 各组大鼠脑干 c-fos mRNA表达 (±s)

表1 各组大鼠脑干 c-fos mRNA表达 (±s)

注:与模型组比较,△P＜0.05;与西比灵比较 ,▲P＜0.05;与正天丸组比较,◇P＜0.05。

分 组 n c-fos正常组 (1) 6 0.27± 0.12△模型组(2) 6 1.19±0.51舒脑欣高剂量组(3) 6 0.63±0.06△▲舒脑欣低剂量组(4) 6 0.30±0.03△◇西比灵组(5) 6 1.05±0.13正天丸组(6) 6 0.77± 0.33△

3.3 舒脑欣滴丸对偏头痛模型大鼠脑干中 c-fos基因表达的影响(图 7-8)

实验结果显示,硝酸甘油诱导偏头痛模型大鼠脑干 c-fos基因表达较正常组明显上调,与模型组和西比灵组比较,舒脑欣高、低剂量组均能下调异常升高的 c-fos基因表达;且舒脑欣低剂量组效果更加显著。

4 讨 论 偏头痛的疼痛主要源于三叉神经支配的硬脑膜、蛛网膜和软脑膜。脑膜血管具有与其它血管相同的解剖和生理特点,刺激脑膜血管可产生搏动性头痛。多数学者认为偏头痛的发病机制是外周伤害性刺激激活中枢和外周的三叉神经血管系统引发头痛发作[1,2]。研究证明,硝酸甘油模型是通过导致脑膜血管扩张、神经源性炎症形成及激活下丘脑、脑干及脊髓节段神经元功能等作用引起三叉神经纤维超敏既诱发头痛[3]。

本实验通过硝酸甘油型偏头痛模型大鼠脑膜切片 HE染色发现,模型组与正常组比较有明显的毛细血管扩张,细胞间结构疏松,组织水肿,大量炎性细胞(以中性粒细胞为主)存在于或渗出血管等现象,表明皮下注射硝酸甘油引起的无菌性炎症确实存在。其他给药组较模型组在上述症状上表现较轻,尤其是舒脑欣高、低剂量组,能明显缓解硝酸甘油引起的神经性炎症。

原癌基因 c-fos属于即刻早期基因,对神经递质、激素、神经冲动及外界剌激引起的传入信息,在数分钟中就会作出反应进行表达。c-fos基因在中枢神经系统内的表达与痛觉调控密切相关[4]。 Hunt[5]发现,外周的伤害性疼痛剌激可以快速透导中枢神经系统 c-fos的表达。也有学者研究发现[6,7],一些治疗偏头痛的药物对偏头痛发作期异常升高的 c-fos有抑制作用。由此可见,c-fos基因异常表达与偏头痛必定存在内在联系。因此,本实验考察舒脑欣滴丸对偏头痛模型大鼠脑脑干中 c-fos mRN A表达的影响,结果显示,硝酸甘油诱导偏头痛模型大鼠脑干 c-fos mRNA表达较正常组明显上调,且具有显著性差异,舒脑欣高、低剂量组均能下调异常升高的 c-fos mRNA表达,舒脑欣低剂量组效果更为明显。

综上所述,舒脑欣滴丸对偏头痛模型大鼠的治疗作用可能是通过改善硝酸甘油引起的脑膜神经性炎症、抑制脑干异常上调的 c-fos基因表达,从而缓解偏头痛的症状而实现的。

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[3] 郭 琳,洪治平.硝酸甘油型实验性偏头痛模型原理与研究现状[J].中国疼痛医学杂志,2004,10(6):357-364.

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[5] Hunt SP,Pini A,Evan G.Induction of c-fos-like protein in spinal cord neurons following sensory stimulation[J].Nature,1987,328(6131):632-634.

[6] Moskowitz M A.Neurogenic Versus Vascular mechanisms of sumatription and ergot alkaloids in migraine[J].Trends Pharmacol Sci,1992,(13):307-311.

[7] TassorelliC,Nappi G,Joseph SA. Systemic nitroglycerin induces Fos immunoreactivity in rat brain[J].Experimental Headache Models,1995,3(4):229-234.