水稻微小RNA研究进展

彭建斐，戴良英，何玉科，许永汉

（1.湖南农业大学生物安全科学技术学院，湖南 长沙 410128；2.上海植物生命科学研究院，上海植物生理生态研究所，上海 200032；3.浙江省植物代谢基因工程重点实验室，浙江省农业科学院，病毒学与生物技术研究所，浙江 杭州 310021）

微小RNA（miRNA）是一种广泛存在于真核生物中的21 nt左右的非编码小分子RNA，绝大多数是真核生物基因表达的一类负调控因子。它主要在转录后水平上通过介导mRNA靶分子的切割或降低靶分子的翻译来调节植物基因的表达，从而调控植物器官的形态建成、生长发育、激素分泌与信号转导以及植物对外界环境胁迫因素的应答能力。尽管植物微小RNA（miRNA）研究起步较晚，但由于鉴定方法的不断发展，植物miRNA的报道数量呈几何级数增长。水稻作为单子叶模式植物和主要的粮食作物，其微小RNA（miRNA）研究也取得了长足的进步。

1 水稻miRNA的生物合成

1.1 miRNA生物合成步骤

植物miRNA基因由RNA聚合酶II转录成为初级的转录本（pri-miRNA），pri-miRNA具有一段并不完全互补的双链RNA区域，和一个大的发夹结构[1]。接着，Pri-miRNA在RNA聚合酶III（Dicerlikel，DCLl）的作用下，被剪切成双链的miRNA/miRNA*前体（pre-miRNA）[2-3]。这一对双链的RNA分别被称之为指导链和伴随链，与miRNA*的5′端相比，miRNA的5′端配对更不稳定，可能正是这种特点导致了miRNA最终进入RISC复合体，miRNA*被排除在RISC外而降解[4]。

1.2 miRNA生物合成相关蛋白

Dicer-like1（DCL1）是miRNA生物合成所最必需的蛋白，DCL1将具有发夹结构的pri-miRNA剪切加工成双链的pre-miRNA。Dicer酶具有一个位于氨基酸末端的DExH-box RNA解旋酶结构域，一个在ARGONAUTE（AGO）也具有的PAZ结构域，两个RNaseⅢ结构域和一个碳端的dsRNA结合结构域[5]。水稻中具有 6个 DCL1蛋白 OsDCL1、OsDCL2a、OsDCL2b、OsDCL3a、OsDCL3b 和 OsDCL4[6]。曹晓风等[7-8]通过RNA干扰技术（RNAi）获得了OsDCL1和OsDCL4功能缺失的水稻转化体，深入研究显示，miRNA含量在dcl1转化体中显著下降，而在dcl4转化体中却没有明显变化，表明OsDCL1对于miRNA的发生具有重要的作用。

ARGONAUTE（AGO）是一种miRNA的效应复合体，能与成熟的miRNA结合形成RNA诱导的沉默复合体（RISC）来调控靶基因的表达。AGO蛋白质主要包含两个结构域：PAZ和PIWI结构域，但具体功能现在尚不清楚。最近的研究表明，PAZ结构域结合到siRNA的3′的二核苷酸突出端；一些AGO蛋白质的PIWI结构域赋予slicer以内切酶的活性。同时，不同的AGO蛋白质有着不同的生物学功能。北京生命科学研究院的戚益军研究组[9]同样利用RNAi技术同时沉默了水稻的4个AGO1基因，研究显示，水稻转化体出现了复杂的发育表性，还发现AGO1蛋白具有切割mRNA的活性，并且它们都对U起始的小分子RNA具有偏好性。作者进一步克隆了与AGO1结合的小分子RNAs并进行高通量测序，发现AGO1s主要结合已知的miRNAs，表明这些AGO1对调节水稻的生长发育有着重要的作用。

在植物miRNA合成途径中，还有其他非常重要的蛋白起着非常重要的作用，HYL1（HYPONASTIC LEVEAL 1）和 SE（SERRATE）被认为能够帮助DCL1精确快速地剪切双链RNA产生pre-miRNA[10]。HEN1具有甲基转移酶的结构域，可在体外甲基化miRNA/miRNA*双链，而miRNA的3′末端甲基化可以稳定miRNA.大多数甲基化的miRNA/miRNA*在转运蛋白HST（HASTY）的帮助下从细胞核转移到细胞质中[11]。然而在水稻中这些蛋白的功能尚未清楚。

2 水稻miRNA的功能研究

2.1 miRNA参与水稻发育调控

Chris A Helliwell等[12]研究小组研究发现，在水稻中过表达miR172能够延缓水稻开花时间，从而导致水稻花器官和种子发育异常，结实率低和种子重量下降。深入研究发现miR172抑制了AP-2家族中SUPERNUMERARY BRACT（SNB）和其他靶基因的表达。在拟南芥中，miR172的功能已经得到了很好的诠释，miR172控制了开花时间和花器官的分化。

2.2 miRNA参与逆境胁迫

林鸿宣等[13]研究小组发现miR169家族的成员都会受到高盐胁迫的诱导，在干旱和高盐的处理下，检测到受处理水稻体内miR169表达普遍上调。深入研究显示miRNA169受dehydration-responsive element（DRE）的诱导。与此同时，miR169n还受到了ABA的上游调控，影响了NF-YA基因表达[14]，从而参与水稻抗旱功能表达。

2.3 miRNA参与激素传导

吴平等[15]在探索OsSPX基因在耐磷饥饿机制过程中发现，OsSPX3能够调控miR399的表达，同时发现OsIPS1能与miR399相互协作调控了Os－PHO2，从而在水稻耐低磷中起着重要的作用。此外，该实验组对水稻抗生长素的突变体osaxr的芯片数据进行分析，发现一些miRNA降低了植株的生长素敏感性。深入研究发现，这些miRNA的启动子中存在生长素响应因子（AuxREs），Yang 等[16]发现水稻miR167的表达受生长素的诱导上调，并在转录后指导对水稻ARF8的mRNA剪切。miRNA对水稻不定根的发育也有着重要的调节作用，miR164也在水稻中有着组织上的特异表达[17-18]。一些miRNA可在受脱落酸（ABA）、赤霉素（GA）、茉莉酸（JA）、水杨酸（SA）和其他植物激素诱导的组织中检测到，如 miR159、miR160、miR164 和 miR167。

2.4 miRNA参与抗病毒感染

病毒感染是一个广泛影响植物生长发育的生物因素，每年因植物病毒感染而导致大多数农作物和果树减产30%左右。在长期的进化过程中，植物已经形成了一些抵制病毒感染的机制，其中一种机制就是病毒介导的转录后基因沉默。已有越来越多的证据表明miRNA与病毒介导的疾病以及病毒诱导的基因沉默有关。现已从植物病毒中鉴定出的RNA沉默抑制因子有30多种，如p19、p21、p25和p69等，这些抑制因子通常称为致病因子。致病因子通常可阻碍siRNA的形成，或影响siRNA的稳定性，或干扰siRNA与RISC复合物的结合，并能导致植物的一些相关疾病的产生和引起发育畸型。

3 水稻miRNA的鉴定和实验验证

3.1 水稻miRNA的鉴定

加州大学基因组生物学研究中心与植物科学系的朱健康教授等[19-20]从水稻的根、茎、花组织中，构建出了3个miRNA的cDNA文库。他们已经鉴定出35个miRNA分子，其中有14个miRNA分子是首次被发现的，并且证明了13个全新的miRNA家族。在这14个首次发现的miRNA分子中，有13个在拟南芥基因组中找不到保守区域。其中4个与亲缘关系较近的单子叶植物有相关的保守性。推测这4个miRNA分子是单、双子叶植物分化后进化形成的。剩余的9个新发现的miRNA在其他植物的已知序列中寻找不到相似序列。在被检的水稻组织中，miRNA分子得到广泛的表达，尽管有许多miRNA显示为组织特异性表达。朱教授对水稻中全新miRNA的鉴定，说明这些小RNA分子可能在水稻中独立演化，而在其他植物中渐渐消沉。

另外，通过非生物的逆境胁迫，研究人员发现了很多原本表达丰度不高的miRNA，曹晓风等[21]通过构建水稻低温、干旱、高盐、ABA和对照的5种cDNA文库，通过克隆18～26 nt的小RNA并测序，检测到了7种与水稻抗逆相关的新miRNA。同样，在对水稻进行重金属镉胁迫的时候也发现了19种新的miRNA，表明许多miRNA在水稻的生长发育和逆境胁迫应答中起着重要的作用[22]。

特拉华大学的科学家与美国国内外的同事合作，发现了一种新型分子，它可以关闭水稻的基因[23]。他们发现的新型分子称为自然反义微RNA（natmiRNAs），由长度大约20个核苷的短小的核糖核酸组成，它们的靶标是位于水稻细胞DNA反向链上它们直接面对的基因。由于天然的碱基互补能够被Dicer类的RNA酶切割，从而降解靶基因的表达水平。

3.2 水稻miRNA的靶基因预测

目前，大多数实验室将计算机分析与实验方法结合使用，使得miRNA的数量呈几何级数增长。但是寻找已知的miRNA基因的靶位点的工作进展并不理想，现在大多数实验室是利用生物信息学手段预测miRNA所作用的靶基因的功能，而缺乏可靠的实验依据。因而寻找并分离出靶基因也是一项比较艰巨而重大的工作。

4 miRNA的技术应用

尽管植物miRNA调控发育过程的复杂性和多样性还没有完全被解析，但已经有报道成功利用miRNAs进行基因工程和基因功能研究的操作。利用人工miRNAs（artificial miRNAs）可以进行组织特异性的、可诱导性的、部分基因失活或几个序列相关基因同时激活的转基因介导基因沉默。例如构建一个同时具有3个不同靶基因（Pds，Spl11和d Eui1/CYP714D1）的人工miRNA载体转入水稻，会发现其靶基因的表达水平都降低了，并且转化体出现了预期的表型，能够稳定遗传[24]。因此人工miRNAs提供了一种新的敲除基因的手段，大大方便了对目的基因进行功能研究。

5 讨论

在短短的8 a时间内，植物miRNA的研究取得了突飞猛进的成果，它为植物生物学的研究提出了新的研究思路。水稻作为一种单子叶模式植物和重要的粮食产物，其miRNA成为了当今分子生物学研究的热点领域。越来越多的植物生长发育的机理被揭示出来，同样，也出现了越来越多新的问题摆在我们面前。如miRNA对多个靶基因的网络调控具体机制是怎样的，miRNA作用过程中是否有放大效应，水稻中究竟有多少miRNA，如何查清楚水稻中的miRNA并找出它们的靶基因和揭示它们的功能。只有揭示其作用的靶基因后才能更好地进行功能研究，从而也才可以弄清楚它在生命活动中的作用。虽然目前的研究已经揭示出了大量的miRNA，但是其下游的靶基因以及功能的研究并没有太多的进展。水稻miRNA和小RNA的研究还有很长的路要走。

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