人血清IgG类抗LDH-C4抗体的ELISA检测及其意义

陈 平,兰风华*,辛 娜,张 朵,陈 勇,苏东辉

(1.南京军区福州总医院分子医学研究中心,福建福州 350025;2.福建医科大学免疫学系,福建福州 350004)

人血清IgG类抗LDH-C4抗体的ELISA检测及其意义

陈 平1,兰风华1*,辛 娜1,张 朵1,陈 勇1,苏东辉2

(1.南京军区福州总医院分子医学研究中心,福建福州 350025;2.福建医科大学免疫学系,福建福州 350004)

目的建立检测人血清IgG类抗精子特异性乳酸脱氢酶(LDH-C4)抗体的ELISA法,探讨人血清抗LDH-C4抗体与免疫性不育的关系。方法以重组人LDH-C4(rhLDH-C4)作为包被抗原,建立人血清IgG类抗LDH-C4抗体检测的间接ELISA方法。应用该方法检测74例健康人群(正常生育组)和177例不育人群(不育组)血清IgG类抗LDHC4抗体。结果初步建立了检测人血清IgG类抗LDH-C4抗体的间接ELISA方法。不育组血清IgG类抗LDH-C4抗体阳性率(30.51%)显著高于正常生育组(9.46%)(P＜0.01),女性不育组阳性率(31.46%)与男性不育组(29.55%)差异不显著(P＞0.05)。结论人血清中存在着IgG类抗LDH-C4抗体,此类抗体可能与免疫性不育有密切关系。

抗精子抗体;乳酸脱氢酶C4;免疫性不育;酶联免疫吸附测定法

(Chin J Lab Diagn,2010,14:1399)

精子特异性抗原与受精和胚胎的早期发育关系密切,在精子获能、顶体反应、精卵识别、精子穿过透明带、精卵融合以及受精卵分裂等过程中起重要作用[1]。其中,部分抗原(如FA-1、LDH-C4、PH-20等)在一定条件下可诱导机体产生相应的特异性自身抗体,影响精子的受精能力,从而导致免疫性不育。有学者用不育患者血清中提取的抗精子抗体(antisperm antibodies,ASA)对睾丸cDNA文库表达进行筛选,发现最具特征性、最有效的精子特异性抗原为精子特异性乳酸脱氢酶,即乳酸脱氢酶C4(lactate dehydrogenase C4,LDH-C4),该蛋白质诱导的抗生育作用已在多种哺乳动物(包括灵长类)得到验证[2]。到目前为止,国内外很少有人对不育患者血清中抗LDH-C4抗体水平进行酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测。

1 材料与方法

1.1 血清

1.1.1 不育组血清 共177份,取自2005年8月-2006年1月间就诊于南京军区福州总医院生殖医学中心的不明原因不育患者,年龄23-50岁,男性88例,女性89例。

1.1.2 生育组血清 共74份,取自同期在南京军区福州总医院体检中心的体检健康者,均已生育,年龄30-45岁,男性35例,女性39例。

1.1.3 处女血清 25份,由南京军区福州总医院检验科提供,年龄＜10岁。

1.1.4 已知阳性和阴性血清 以纯化的rhLDH-C4抗原为基质,对不育患者血清行免疫印迹检查。选取其中对rhLDH-C4反应性较强的血清作为已知阳性血清。处女血清中,经同样方法,证实对rhLDHC4无反应性的血清,当作已知阴性血清。

1.2 重组hLDH-C4抗原的制备 取异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导的重组菌BL21(DE3)(带重组质粒pET28a-hLDHC,本室构建)菌液1 000 ml离心,收集菌体,重悬于10 ml结合缓冲液(50 mmol/L NaH2PO4,300 mmol/L NaCl,10 mmol/L imidazole,pH8.0)中。加入 Triton X-100 100μ l和溶菌酶(10 mg/ml)100 μ l,并加入DNA 酶Ⅰ ,在液氮中和37℃恒温水浴箱中反复冻融4次,以裂解菌体。4℃条件下,14 000 r/min,离心10 min收集上清。按照His-Tag融合蛋白纯化试剂盒(德国Qiagen公司)说明书进行条件优化后,用Ni螯和层析柱对上清中的重组hLDH-C4(rhLDH-C4)进行分离纯化,用PIERCE公司蛋白定量试剂盒测定其含量。

1.3 间接ELISA方法 在微量板上,将rhLDHC4抗原用碳酸盐缓冲液(0.05 mol/L,pH9.6)稀释成1 μ g/ml,每孔加 100 μ l,4℃过夜 ,用 PBST(1XPBS,0.05%吐温-20,pH7.4,以下同)洗涤3次。用封闭液(4%BSA-PBS)于37℃封闭2 h。加入1∶100稀释的待检血清,并用已知阴性和阳性血清作对照,37℃1 h。洗涤后加入稀释的HRP标记的鼠抗人IgG抗体(SBA公司产品),37℃作用1 h后洗涤。加底物TMD(四甲基联苯胺)溶液,37℃避光反应20 min,用酶标仪于450 nm处测定各孔的吸光度值。

1.4 酶标抗体最适工作浓度的确定 用100 ng/ml人IgG(Sigma公司产品)包被酶标板,与作一系列稀释的酶标抗体反应后,在波长为450 nm处测其吸光度值(A450 nm),见在稀释度为1∶20 000时,A450 nm约为1.0,故确定1∶20 000为酶标抗体最适稀释度[3]。

1.5 抗原最适包被浓度的确定 rhLDH-C4抗原分别以 0.125 μ g/ml、0.25 μ g/ml、0.5 μ g/ml、1 μ g/ml、2 μ g/ml和 4 μ g/ml浓度包被酶标板,阴性 、阳性对照血清标本按1∶100稀释,酶标抗体工作浓度为1/20 000。当包被抗原浓度为 1.000 μ g/ml时,阳性对照的A450 nm＞0.1,阴性对照的A450 nm＜0.1,且两者比值(2.812)最大,故选择1 μ g/ml作为实际抗原包被。

1.6 血清标本的检测 用上述ELISA方法,对74份生育组血清、177份不育组男女血清中IgG类抗LDH-C4抗体水平进行检测。

1.7 统计学分析 应用 χ2检验(α=0.05),分别比较不育组与生育组之间的阳性率差异,以及男性不育组与女性不育组之间的阳性率差异。

2 结果

2.1 rhLDH-C4抗原的纯化

1 000 ml菌液经 IPTG诱导表达及纯化后,得1.5ml、浓度为1.0 mg/ml的rhLDH-C4制备液。取约5 μ g纯化蛋白进行12%SDS-PAGE电泳,纯化蛋白仅显示单一区带,分子量位于45 μ与30 μ之间,与预期相符(hLDH-C4分子量约为35 μ,图1)。

图1 纯化rhLDH-C4的聚丙烯酰胺凝胶电泳

2.2 间接ELISA方法的建立

2.2.1 阳性切割值的确定

以处女组血清标本A450 nm值的平均值加3个标准差(s)作为阳性切割值(cut-off value),A450 nm值≥阳性切割值判定为阳性,A450 nm值＜阳性切割值判定为阴性[4]。rhLDH-C4抗原以 1 μ g/ml包被,酶标抗体工作浓度为1∶20 000,测定25例女童血清标本的A450 nm值,计算其平均值为0.042,s为0.027,故算得阳性切割值为0.123。

2.2.2 重复性试验

取阴性和阳性的血清标本各一份,分别同时作4次测定,测得A450 nm值的批内变异系数分别为8.89%和5.02%。另外,连续4天测定同一份阴性血清标本和阳性血清,计算A450 nm值批间差异,变异系数分别为8.51%和1.92%。

2.3 血清标本的检测

以74例生育者血清标本作为正常对照,用上述建立的间接ELISA方法检测177例不育者血清IgG类抗LDH-C4抗体,阳性率为30.51%(54/177),而对照组仅为9.46%(7/74),两组的阳性率有极显著差异(χ2为12.57,P＜0.01)。此外,在 177例不育患者者中,男性患者阳性率为29.55%(26/88),女性患者阳性率为31.46%(28/89),阳性率差异不显著(χ2为0.08,P＞0.05)。

3 讨论

众多的研究证实,LDH-C4抗原是影响生育过程的一种关键的精子特异性抗原,与精子的生成、代谢、获能等有密切关系[5]。人工免疫LDH-C4抗原可在多种哺乳动物体内诱导抗LDH-C4抗体产生,后者可导致动物的生育率明显下降[6]。本实验应用纯化的rhLDH-C4抗原作为包被抗原,确定了最适抗原包被浓度及阳性切割值,优化检测条件,初步建立了检测人血清IgG类抗LDH-C4抗体的间接ELISA方法。试验显示,该法的批内及批间差异均＜10%,具有良好的重复性。

应用本实验建立的ELISA方法,对不育患者血清中IgG类抗LDH-C4抗体水平进行检测,结果显示:男女不育组血清IgG类抗LDH-C4抗体阳性率高达30.51%,而对照组仅为9.46%,提示人血清抗LDH-C4抗体可能与不育症具有密切关系。另外,对照组少数标本抗LDH-C4抗体也出现阳性结果,可能原因是:本研究的对照组标本均来自生育后的夫妇,其抗体阳性可能发生于孕后或生育后——既往有生育史不等于取样当时或其后生育力不受抗体影响。另外,不育可能与抗体滴度有关。有学者认为,血清中ASA阳性需看其滴度高才有临床意义,低滴度的ASA不影响生育[7]。换言之,低滴度的抗LDHC4抗体可能不足以完全阻断生育。

在177例男女不育患者中,男性患者阳性率为29.55%,女性患者阳性率为31.46%,两者无显著差别。这项结果显示,不管是男方或者女方产生抗LDH-C4抗体都可能导致不育。在男性方面,精液中存在抗LDH-C4抗体时,该抗体可能在男性生殖道通过抑制精子上LDH-C4的酶活性,降低男性精液的质量,导致精子活力减弱、穿透力降低,从而阻碍精子在女性生殖道的穿行;在女性方面,女方生殖道分泌液(如宫颈黏液、卵泡液等)中存在抗LDH-C4抗体时,不同类型的抗体(尤其是分泌型IgA)结合到精子表面上,通过凝集或制动作用,显著地降低精子对宫颈黏液的穿透力及精子在子宫输卵管的运行,从而干扰精卵结合,甚至有可能影响到受精卵的着床和发育。

本研究建立的抗LDH-C4抗体间接ELISA法与临床上常规使用的ASA斑点免疫胶体金渗滤检测法进行了初步比较(结果略),观察到ASA斑点免疫胶体金渗滤检测法阳性率低于抗LDH-C4抗体间接ELISA法,且ASA检测阳性的标本,抗LDH-C4抗体检测未必一定阳性,反之亦然。由于目前临床上ASA检测试剂盒所用的抗原基质是精子抗原粗提物,成分多,针对其中大部分精子抗原的ASA与免疫性不育关系不大,部分与不育密切相关的抗原成分在所用的抗原基质中含量偏低,因此,ASA检测的敏感性及特异性不高,检测结果的临床意义有限。本实验建立的ELISA方法是以单一精子特异性rhLDH-C4作为包被抗原,仅针对血清抗LDH-C4抗体进行检测,避免了非特异蛋白成分的干扰,提高了检测的敏感性及特异性。

本研究首次研究了以rhLDH-C4作为ELISA包被抗原检测血清抗LDH-C4抗体的可行性,并首次对不育患者血清中IgG类抗LDH-C4抗体进行检测。由于目前国内外尚未建立免疫性不育的诊断标准,也未制备抗LDH-C4抗体的标准人血清,该方法的敏感性及特异性有待以后研究进一步验证。尽管如此,该方法的建立将为其它抗精子特异性抗原抗体检测方法的建立提供有益的借鉴。

[1]Bohring C,Krause W.The role of antisperm antibodies during fertilization and for immunological infertility[J].Chem Immunol Allergy,2005,88(1):15.

[2]Diekman AB,Herr JC.Sperm antigens and theiruse in the development of an immuno-contraceptive[J].Am J Reprod Immunol,1997,37(1):111.

[3]白 玲,张志刚,刘永明.合成肽抗原抗精子抗体ELISA试剂盒的研究[J].广西医科大学学报,2004,21(4):497.

[4]沈关心,周汝麟主编.现代免疫学实验技术[M].武汉:湖北科学技术出版社,1998.119.

[5]Sawane MV,Kaore SB,Deshkar AM,et al.Seminal LDH-C4 isoenzyme and sperm mitochondrial activity:a study in male partners of infertile couples[J].J Med Sci,2002,56(11):560.

[6]Shi SQ,Wang JL,Yang Y.Oral feeding and nasal instillation immunization with Microtus brandti lactate dehydrogenase C epitope DNA vaccine reduces fertility in mice via specific antibody responses[J].Fertil Steril,2005,84(3):781.

[7]李笑梅,陈永华,汤明礼,等.精子活力与精子畸形率及抗精子抗体回归分析[J].临床检验杂志,1998,16(4):251.

ELISA method for detection of IgG-type anti-sperm specific lactate dehydrogenase antibody in human sera and its clinical significance

CHEN Ping,LAN Feng-hua,XIN Na,et al.(ResearchCenterfor MolecularMedicine,Fuzhou General Hospital of Nanjing Command,PLA,Fuzhou,Fujian350025,China)

ObjectiveTo establish an ELISA method for the detection of IgG-type anti-sperm specific lactatedehydrogenase antibody in human sera and investigate the relationshipbetween anti-sperm specific lactate dehydrogenase antibody and immune infertility.MethodsAn indirect ELISA was established using recombinant human sperm-specific dehydrogenase(rhLDH-C4)antigen for plate coating and anti-LDH-C4 antibody(IgG type)in the sera from 74 fertile individuals(fertile group)and 177 unexplained infertile patients(infertile group)was detected.ResultsAn indirect ELISA method for detecting IgG type anti-LDH-C4 antibody in human sera was established.Of 177 infertile patients(in infertile group),54 were found positive for serum IgG type anti-LDH-C4 antibody,resulting in a positive ratio of 30.51%(54/177),which was significantly higher than that in fertile group(7/74 or 9.46%,P＜0.01).Within the infertile group,no significant difference of positive ratios were observed between female and male members(31.46%vs 29.55%,P＞0.05).ConclusionThere was IgG-type anti-LDH-C4 antibody in human sera,and this antibody might be closely related to infertility.

sperm;lactate dehydrogenase;infertility;IgG;ELISA

R446.62;R711.6

A

1007-4287(2010)09-1399-03

福建省科技攻关重点课题(2002Y032)

*通讯作者

陈 平(1979-),男,硕士研究生,从事免疫学研究。

2009-12-15)