RAPD分子标记对药用植物大花红景天濒危原因分析

徐进，陈新，彭成

大花红景天(R.crenmulata.H.Ohba)是《中华人民共和国药典2005版》收录的唯一红景天的药用品种。主要分布于四川川西高原的阿坝州和甘孜州，以及西藏的广大地区。生长在海拔4500 m－5000 m的高山顶上。由于它具有适应原样性作用，以及治疗心血管疾病等诸多方面的药理活性，而一度成为研究和开发的热点。随着大花红景天资源储量的日益减少，保护这种珍贵的药用植物，使其达到可持续的开发和利用，就成为了大花红景天研究的重要内容。对大花红景天种群遗传多样性的深入研究将有助于我们了解其濒危的可能原因，指导更好的制定保护政策。

随机引物扩增多态性DNA技术(random amplified polymorphic DNA，RAPD)可直接反映生物体内 DNA分子水平上的多态性，已广泛应用于植物遗传多样性的分析，亲缘关系分析以及品种鉴定等方面的研究。一个物种的消失与否一部分取决于其遗传多样性的水平。利用RAPD分子标记技术研究不同产地大花红景天的遗传多样性，将有助于从分子层面探究其濒危的可能原因。指导我们对这种珍贵的药用植物资源进行有效的保护。

1 材料与方法

1.1 材料

采集不同海拔高度的五个产地的大花红景天幼嫩叶片，用变色硅胶干燥保存。材料具体来源见表1。

?

1.2 仪器与试剂

CTAB(美国Sigma公司);Tirs(上海生工);EDTA(上海生工);Taq 酶(dNTP，10 ×buffer，Mg2+)(大连宝生物生命科技公司);Goldview染料(北京赛百盛生物工程公司);DNA Maker15000，DNA Maker2000(大连宝生物生命科技公司);RAPD随机引物(北京赛百盛生物工程公司);琼脂糖(美国sigma公司);PCR仪(美国贝克曼公司);凝胶成像系统(美国贝克曼公司);恒压恒流电泳槽(北京六一仪器厂)。

1.3 大花红景天DNA的提取

采用改良的CTAB法提取［1］，取约100mg干燥的叶片于研钵中－70℃冷冻过夜，取出后迅速研磨成细粉，加入 700μL2%CTAB于金属浴上 65℃保温45min，期间振摇2－3次。取出放至室温加入等体积氯仿/异戊醇(24:1)抽提两次，10000 r·min－1离心10min。吸取上清液加入体积异丙醇沉淀DNA，－20 ℃保存60min，取出室温解冻，10000 r·min－1离心10min，用80%乙醇清洗沉淀两次，室温挥干至无醇味。100μL超纯水37℃溶解DNA，加入0.01g/mL的 RnaseA 2μL，37 ℃保温 30min。加入400μL 超纯水后，用等体积氯仿/异戊醇抽提1次，吸取上清夜加入体积的异丙醇沉淀DNA，－20℃保存60min，取出室温解冻，10000 r·min－1离心10min，用80%乙醇清洗沉淀2次，室温挥干至无醇味，100μL超纯水37℃溶解DNA。1%琼脂糖凝胶电泳检测后，－20℃保存备用。

1.4 大花红景天RAPD反应条件的优化

对PCR扩增的主要影响因素包括DNA模板浓度，随机引物浓度，dNTP浓度，Mg2+浓度，Taq酶用量进行正交实验优化［2，3］，单因素优化退火温度以及循环次数，最终确定的PCR反应参数是:反应总体积20μL，ddH2O 11.1μL;DNA 模板 1.5μL，随机引物(1mmol/l)1μL;dNTP(0.25mmol/l)2μL;Mg2+(2.5mmol/l)2μL;Taq 酶(5u/μl)0.4μL;上覆盖20μL矿物油。

扩增反应程序为:94℃预变性5min，然后再按94℃变性1min，37℃退火1min，72℃延伸1.5min，扩增40个循环，最后再72℃延伸4min

反应产物在1.4琼脂糖凝胶电泳上检测，自动成像仪照相并保存。

1.5 数据统计分析

经电泳后按琼脂糖凝胶同一位置上DNA条带的有无进行统计，有带包括弱带记为“1”无带记为“0”构建RAPD原始数据，采用RAPDdistancel.04软件包计算多态位点百分率，遗传距离以及构建亲缘关系树系图。

2 结果与分析

2.1 RAPD随机引物的筛选

以其中一个产地大花红景天的DNA为模板，对40条随机引物进行筛选，初步筛选后有16条随机引物，用这16条随机引物对5个产地的大花红景天进行PCR扩增，结果有12条引物对5个产地的大花红景天均可扩增出清晰且稳定的DNA条带，这12条随机引物的名称及碱基序列见表2。

?

2.2 不同产地大花红景天DNA的多态性分析

用筛选出的12条随机引物对5个产地的大花红景天的DNA进行扩增，结果12条随机引物共扩增出99条DNA带，其中79条DNA条带显示出多态性，占总条带的79.9%。不同随机引物扩增出的DNA条带数差异较大，结果见表3。12条随机引物扩增出的DNA条带数在5－12条之间，平均每条随机引物扩增出8.25条DNA条带，其中多态性条带6.66条，占其中的80.7%

?

图1 大花红景天总DNA提取

2.5 各产地大花红景天的遗传距离及聚类分析

采用RAPDdistance1.04统计软件包对RAPD分析后的原始数据进行遗传距离的计算，结果见表4;构建的亲缘关系树系图，见图2。

?

遗传距离的大小反应了亲缘关系的远近，遗传距离越大表明亲缘关系越远，反之，遗传距离越小则亲缘关心越近。从遗传距离矩阵的结果可以看出:5个大花红景天居群的遗传距离在0.4784－0.7774之间。其中马尔康和康定两个产地大花红景天的遗传距离最小为0.4784，表明二者的亲缘关系最近。红原和林芝的遗传距离最大为0.7774，表明二者的亲缘关系越远。

图2 大花红景天不同产地的聚类树系图

基于遗传相似系数构建的亲缘关系树系图显示，首先是马尔康和康定居群聚在一起，其次是与红原居群相聚，再与小金居群相聚，最后和林芝居群聚类在一起。这也符合川西高原与西藏在地理上有一定距离的间隔，西藏那曲居群作为一个独立的居群最后才与其他居群相聚。

3 讨论

多态位点百分率可以做为度量遗传多样性高低的指标。［4］大花红景天的多态位点百分率表明，大花红景天具有较高的遗传多样性。在考虑到其恶劣的生长环境以及相对狭窄的分布区，可以说大花红景天的遗传多样性是十分丰富的。

遗传距离越大，说明居群之间的亲缘关系越远。通过RAPD分子标记技术分析得到的大花红景天的遗传距离表明大花红景天五个居群的亲缘关系较远。这可能是因为各居群之间的空间间隔较大，不易进行居群间的遗传信息交流所致。

一般认为物种的濒危主要原因是遗传多样性的降低，而遗传多样性的单一会导致适应外界环境能力的下降，因此就很容易受到生境改变的影响，一但生境发生变故，该物种相对就易于导致灭绝。［5］通过研究表明，大花红景天的遗传多样性十分丰富，因此可以初步认定其濒危的可能原因是由于人为因素造成的，故挽救大花红景天首先应该改善该物种所面临的人为破坏的确定性威胁。

虽然大花红景天是进行有性生殖的植物，其有利于各居群进行遗传信息的交流，但大花红景天的自身生物学特性就一定程度的促使了其濒危，大花红景天的花粉和孢子的自身特点都不利于其传粉和受精;且生长环境十分恶劣，传粉昆虫就相对较少，其生长的流石滩土壤层又比较稀薄，不利于种子生根发芽;繁育期雨量较大，晴好天气较少，致使花粉传播受限。以上都一定程度的影响了该物种居群的繁殖和扩增。

通过RAPD分子标记技术对大花红景天遗传多样性的分析，以及根据其自身的生物学特性，提出就地保护的保护措施，即实施保护区保护。大花红景天自身具有丰富的遗传多样性，在解除了人为破坏的威胁下，居群能够实现自身的更新，人为增加保护区昆虫的数量，促使大花红景天居群间遗传信息的交流，以减少居群间的空间隔离效应，从而增加有效居群的大小，改善小居群因基因交流少而衰退，以及遗传变异的丧失。

实现对大花红景天这一濒危的药用植物的有效保护，令其可持续的发展，就能够更好的为人类造福。

［1］蓝云龙，吴令上，裘波音，等.鱼腥草RAPD分子标记的多态性［J］.浙江林学院学报，2008，25(3):309.

［2］陈少瑜，杨恩，张雨，等.云南核桃品种遗传多样性的RAPD和ISSR 标记研究［J］.河北林果研究，2007，(1):22.

［3］宋书娟，李雅轩，郭平仲，等.RAPD分子标记与群体遗传多态性分析［J］.首都师范大学学报(自然科学版)，2000，21(2):52.

［4］张文彪，金则新，李均敏.不同生境夏腊梅群体遗传多样性的 RAPD 分析［J］.植物研究.2007，27(3):313.

［5］ZHANG Ren － Bo，DOU Quan － Li，HE Ping.Analysis of genetic diversity in thuja sutchuenensis populations as revealed by morphological and molecular data［J］.Guihaia，2007，27(5):687.