黏细菌生物活性物质的研究

刘冰花

(成都大学医护学院,四川成都 610091)

0 引 言

黏细菌是最高等的原核生物,可滑动,具有多细胞行为,属于好氧的革兰氏阴性杆菌[1].由于黏细菌生长缓慢,难于分离纯化,对其活性物质的研究相对滞后.近年来,黏细菌作为可产生丰富多样生物活性物质的微生物类群逐渐受到科研工作者的重视.迄今为止,研究人员已经发现了黏细菌产生的几百种结构不同的化合物,这些化合物中许多是以前从未发现过的.本文对1999年至今科研人员在黏细菌生物活性物质方面的研究工作进行综述,以期对黏细菌进一步的研究工作有所帮助.

1 黏细菌生物活性物质功能研究

相关研究发现,一株黏细菌可以产生多种不同功能的生物活性物质,并且黏细菌产生的生物活性物质结构奇特,表现出菌株特异性,而不是种或属特异性.

1.1 黏细菌抗肿瘤活性研究

近10多年来,关于黏细菌中发现抗肿瘤活性物质的报道很多,例如:Ahn等[2]从黏细菌Myxococcus fulvus的次级代谢物中分离得到myxothiazol和一种新物质KR-025,并发现myxothiazol和KR-025对人类肿瘤细胞均有明显抑制作用;施晓琼等[3]从黏细菌菌株Myxococcus xanthus 095B06中分离到5种明显抑制肿瘤细胞SMMC-7721、Hela的生长的活性物质,它们分别为Avermectin A1a、Avermectin A2a、Avermectin B1a、Avermectin B2a、麦角甾-7,22-双烯-3,5,6-三醇(赛勒维甾醇).李健、胡玮等[4,5]从黏细菌Corallococcus coralloides Cc9736菌株的发酵产物中分离到一种具有抑瘤活性的生物活性物质CcC;马中良、李艳利等[6-8]从纤维堆囊菌菌株so oe cpu-1中均发现了对多种肿瘤细胞有良好抑制作用的SCC;郭文杰等[9-11]从菌株Polyangium vitellinum JsW103和另外6株黏细菌菌株中也发现了活性较强的抗肿瘤物质.

此外,从相关的报道中可以看到,堆囊菌属和黏球菌属产生抗癌活性物质的几率较高,研究人员在研究中发现纤维堆囊菌子实体不但对于肿瘤细胞如肝癌Be17402株系具有很强的体外杀伤活性,其子实体提取物灌胃对小鼠无毒性反应,并能够明显抑制移植瘤S180的生长[12].同时,研究人员还发现同一株黏细菌的代谢产物可以有多个组分具有抗肿瘤活性,但这些代谢产物在在抗肿瘤机制上可能具有显著的多样性[13].这些研究说明,黏细菌在抗肿瘤药物的开发方面具有极大的潜力.

1.2 黏细菌抗细菌活性研究

黏细菌可以产生多种结构独特的抗细菌抗生素,例如,Irschik等[14]从纤维堆囊菌So ce750和So ce1045菌株的发酵液中发现etnangien,研究证明其是一种新的能有效抑制 G+的大环内酯类抗生素,同时,etnangien还可以抑制细菌和病毒的核酸聚合酶活性;Menche等[15]从纤维堆囊菌So ce1045菌株中又发现了etnangien的类似物methyl ester etnangien,其对G+的抑制作用更强,抑制RNA聚合酶的活性与etnangien相当,但对DNA聚合酶不起作用, methyl ester etnangien比etnangien更容易从纤维堆囊菌的发酵液中获得,并且在中性条件下结构比etnangien稳定.

另外,Ahn等[16]从土壤中分离到纤维堆囊菌K M1003,并从该菌的发酵液中发现了 Sorangiadenosine,其是一种新的倍半萜烯腺苷,实验证明,Sorangiadenosine即可抑制 G+,又可抑制 G-;Höfle等[17]发现黏细菌Stigmatella erecta Pd e32菌株可以产生抗细菌物质5-nitroresorcinol(5-硝基间苯二酚).

此外,还有许多在黏细菌中发现抗细菌活性物质的相关报道,例如,Gaspari等[18]评价了97株黏细菌产生的抗菌化合物的产量,发现其中62株有抗菌活性,同时,在一个纯化菌株中发现了一种由黏细菌产生的典型的抗生素Myxovirescin,在3株黏细菌中检出了可抑制原核生物蛋白质合成的,而通常由放线菌产生的异硫霉素(Althiomycin);刘迎等[19]从黄海边土壤中筛选到具有广谱抗菌活性的白色黏细菌So ce cpu-1;殷建华等[20]发现黏细菌CS211菌株对蜡状芽孢杆菌、藤黄八叠球菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌具有很强的抑制作用;刘冰花等[21,22]发现黏细菌Angiococcus sp.菌株胞外物、胞内物均具有抗菌活性,且抗菌谱不同,其中胞外物对G+细菌有较强的抑菌作用,胞内物对部分G+细菌及G-细菌有抑菌作用.

1.3 黏细菌抗真菌活性研究

近年来,研究人员从黏细菌中发现了大量的抗真菌物质,例如,Bode等[23]从黏细菌纤维堆囊菌 So ce705和So ce690的发酵液中发现了结构独特的leupyrrins A1,实验证明它能够较好地抑制真菌和小鼠的成纤维细胞;Kundim等[24]从黏细菌 Cystobacter fuscus AJ-13278菌株中分离得到3种新的抗真菌的不稳定的化合物(6E,10Z)-2′-O-methylmyxalamide D、2′-O-methylmyxalamide D 和 (6E)-2′-Omethylmyxalamide D;马辉等[25]从黏细菌Myxococcus fulvus HW-1的发酵液中分离出9种抑制抗真菌的化合物(1-9).在这9种化合物中,有7种是环二肽,化合物7、8和9属于非天然氨基酸组成的环二肽,均是首次从天然产物中得到的,化合物4、7、8和9均是首次在黏细菌的次生代谢产物中分离得到的.同时,利用稻瘟霉模型和纸片扩散法对分离得到的单体化合物进行抗菌活性评价,发现化合物4、5、7、8和9对稻瘟霉的生长均有明显的抑制作用,化合物4不但能中度抑制稻瘟霉的生长,并且能引起菌丝体末端膨大,化合物4、5、7、8和9对枯草芽孢杆菌有明显抑制作用.

此外,Höfle等[17]发现黏细菌 Stigmatella erecta Pd e32菌株产生一种新的抗真菌物质aurachin P((1′R,2′S,3′R)-1′-aurachin A);Steinmetz等[26]从Myxococcusfulvus菌株中发现了抗真菌物质myxothiazol Z;朱斌等[27]发现黏细菌NUST03菌株可以产生一种强烈抑制黑曲霉的抗生素.

1.4 黏细菌产生酶活性研究

相关研究发现,黏细菌次级代谢物中不但有丰富的抗生素,而且有丰富的酶资源,如纤维素酶、木聚糖酶、溶栓酶等.闫章才[28]首次对溶纤维素黏细菌降解纤维素的机制进行了初步研究,发现纤维素降解酶以复合体的方式组织在菌体细胞表面.侯配斌[29]以S09733-1为研究对象首次对纤维堆囊菌降解纤维素类物质的基本特性进行了较为全面的表征,而且进一步证明了其纤维素降解酶类以一种高效的多酶复合体形式分布于细胞表面,履行相关的功能.上述研究首次在好氧细菌中发现类似的降解酶类组织形式存在,突破了纤维素酶复合体的厌氧界限,具有重要的理论意义.

此外,赵晓飞等[30]从黏细菌Angiococcus sp.的发酵液中分离出一种具有抗凝溶栓双活性的蛋白MF-1,并对其酶学性质进行初步研究,首次从黏细菌中分离得到具有较高抗凝和溶栓双活性的且稳定不易失活的MF-1蛋白;刘敏等[31]以纯化菌株Sorangium cellulosum So 9733-1为材料,对其产木聚糖酶的培养条件进行了优化,得出的适宜培养条件组合是,以滤纸粉为碳源,以(NH4)2SO4为氮源,pH值为7.0,温度为30℃;殷建华等[32]发现黏细菌Myxococcus xanthus CMC 0605菌株产生的纤维素酶的最适pH为6.0～7.0,最适温度40℃.

2 黏细菌生物活性物质结构研究

近年来,科研人员采用气—液色谱、气—相色谱、气—质色谱、核磁共振等先进技术,对部分黏细菌活性物质的化学结构进行了阐明(见表1),但仍有很多黏细菌产生的活性物质结构到目前还没有弄清楚.

3 黏细菌活性物质的生物合成

在研究黏细菌产生的活性物质性质的同时,科研人员也密切关注着这些活性物质在黏细菌体内的合成途径.从1999年至今,研究人员采用同位素标记等方法已经弄清楚了黏细菌多种活性物质的合成途径,例如,aurachin P、5-nitroresorcinol、myxothiazol Z、土臭味素[36,37]、异偶数脂肪酸[38]、myxochelins A和B[39].

表1 1999年至今已阐明结构的主要黏细菌生物活性次级代谢产物及产生菌

此外,Tse等[40]开发了一个在大肠杆菌中用于epothilone前体定向生物合成的埃博霉素合成酶的模块6-9系统,为了系统地探讨了该系统生物合成的潜力,研究人员还研究了在这个工程研究途径中最关键的第一个模块——EpoD-M6,接受、延长和处理底物的能力,发现EpoD-M6被表达、被纯化,并且证明其同时接受酰基辅酶A和acylSNAC底物,被测试的底物中,除了较多的复杂的天然底物外,octanoylSNAC和3 octenoylSNAC被证明是优秀的底物.该研究成果将有利于epothilone类似物和相关复杂的聚酮前体的定向合成.

4 黏细菌生物活性物质基因研究

为了更进一步的认识黏细菌,研究人员对它的基因产生了兴趣,特别是黏细菌决定生物活性物质的基因.

张晓元[41]研究发现,纤维堆囊菌S09733-1木聚糖酶XynB为内切木聚糖酶,由398个氨基酸残基组成,完整基因全长1 197 bp,该酶N端大约100个氨基酸与数据库中的现有序列没有任何同源性,功能未知.高昂[42]研究了XynB N端结构域的功能,结果显示,XynB中氨基酸114～398为糖基水解酶家族10保守区,氨基酸1～113功能未知,在此基础上,成功构建了木聚糖酶XynB N端结构域、C端结构域和完整XynB的异源表达质粒,并在大肠杆菌中实现了异源表达,经过一系列的实验,推测XynB的N端结构域不具有底物结合区等与木聚糖降解有关的功能,XynB N端结构域与XynB在细胞中的定位有关.上述研究为更加深入地研究XynB N端结构域的功能打下了基础.

此外,Sandmann等[43]在黏细菌Angiococcus disciformis An d48里转入了一个鉴别次级代谢物生物合成基因编码调节器的转座子,并用HPLC分析了1 200个转座子突变体的抽提物,发现其中6个突变体的myxothiazol产量增加了30倍,通过转座子及插入位点旁的序列鉴定,发现一些无活性基因编码类似于细菌调节器的蛋白质,如二组分系统和丝氨酸—苏氨酸蛋白激酶.然而,其他基因产物不类似于任何具有特征的蛋白质,实验数据说明通过引入转座子的方法鉴别次级代谢物的调节基因是一种有价值的方法;Perlova等[44]发现了一株新的生长迅速的嗜热黏细菌菌株Corallococcus macrosporus GT-2,对该株黏细菌的理化性质的研究发现,株菌的发酵时间和生长周期都比其他黏细菌短,同时将黏细菌Stigmatella aurantiaca中产生活性物质myxochromides的基因组通过转座子转入GT-2菌株,发现异源宿主GT-2菌株myxochromides的产量明显高于Stigmatella aurantiaca菌株.

5 提高黏细菌生物活性物质产量的方法

想把黏细菌产生的生物活性物质从发酵液中提取并纯化,就必须提高黏细菌产生生物活性物质的产量.

王宁等[45]在研究一株可降解黄曲霉毒素B1的黏细菌的产酶条件时,通过单因素实验和正交实验得到最优化的培养基以及培养条件.李越中等[46]研究影响纤维堆囊菌So ce 90菌株合成epothilone的条件时,发现在指数期接种、低氮高碳培养、某些盐离子如CuSO4、较高浓度的氨基酸混合物和乙酸盐对epothilone的合成有益.刘迎等[19]发现在培养基中添加So ce cpu-1次级代谢产物的粗提物作为诱导物可提高菌株So ce cpu-1次级代谢物的产量.罗立新等[47]发现在利用纤维堆囊菌发酵生产epothilone的工艺中,添加环式糊精到发酵培养基中不仅可以吸附产物同时不影响菌体的生长,还可以减弱产物抑制的现象.

6 黏细菌生物活性物质化学合成

黏细菌产生的生物活性物质已经引起了众多化学合成研究人员的极大兴趣.1999年至今,已经有多种黏细菌产活性物质通过化学合成方法进行了全合成,例如,crocacins A-D[48]、epothilone A和epothilone B[49]、(-)-Ratjadone[50]、(+)-Crocacin D[51]、(-)-Disorazole C1[52]、(-)-Apicularen A[53]、tubulysin的类似物[54]、Melithiazole C[55]、tubulysin U、tubulysin V和它的差向异构体epitubulysin V(不是天然产物)[56].

此外,Krebs等[57]通过一系列化学方法合成了黏细菌Chondromyces crocatus产生的ajudazol A的右半部分的侧链.Höfle等[58]用化学方法半合成了黏细菌产生的活性物质Aurachin E.Smith等[59]建立了高效合成黏细菌次级代谢物(+)-sorangicin A的药效基团二氧双杂环[3.2.1]辛烷中心的合成途径.

值得一提的是,由黏细菌 Sorangium cellulosum分泌的具有抗肿瘤活性的epothilones目前已经作为抗癌新药在全球范围内进行治疗小细胞肺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌、晚期乳腺癌、复发性胶质瘤等癌症的临床试验.

7 结 论

近10多年来,研究人员对于黏细菌产生的生物活性物质的研究已经取得了极大的进展和大量的成果.但总体上看,对于黏细菌这类药用潜力很大的细菌群体来说,上述研究工作还远远不够,比如在抗生素的研究方面,研究人员发现了很多黏细菌可以产生抗生素,但对这些活性物质结构的研究工作还显得有些滞后.同时,关于黏细菌生物活性物质基因工程方面以及其在农业方面的研究工作也显得有些单薄.相信随着人们的关注,将会有越来越多的人力与物力投入到黏细菌的研究中,从而加快黏细菌的开发与应用的进程.

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