乳腺癌线粒体细胞色素氧化酶-Ⅱ基因突变检测

闫斌 韩丽红 于跃利

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，在我国占全身各种恶性肿瘤的7%～10%。近年来，线粒体DNA（m itochond rial DNA，m tDNA）突变与肿瘤关系的研究越来越受到人们的重视，并且在多种人类肿瘤中都已检测到m tDNA突变。本研究拟通过对乳腺癌组织m tDNA的细胞色素氧化酶-Ⅱ区测序分析，了解中国人乳腺癌m tDNA的细胞色素氧化酶-Ⅱ的突变情况，以期为乳腺癌病因学的研究提供实验依据，并为临床乳腺癌的诊断和治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

随机收集2008年1月～2009年1月在包头医学院第一附属医院普外科切除的乳腺癌组织标本20例，以及对应的癌旁组织标本，标本取回后于-80℃冰箱保存，均经该院病理科证实为乳腺癌。

1.2 乳腺癌组织标本m tDNA的细胞色素氧化酶-Ⅱ区PCR扩增

按照DNA提取试剂盒（（Prom gea公司）说明书提取20例乳腺癌组织和癌旁组织的DNA。通过软件分析设计出一对引物，上游引物：5’-atggcacatgcagcgcaag t-3’，下游引物：5’-ggtaaatacgggccctatttc-3’。PCR反应体系50μL，水33.5μL，10×bu ffer（无M g2+）5μL，上、下游引物各1μL，4×dNTP4μL，25mM的Mgcl24μL，Taq DNA聚合酶0.5μL（试剂均来自Promega公司），DNA模板1μL。PCR反应条件：94℃5m in；94℃15s，65℃30s，72℃40s，35个循环。产物于1%琼脂糖凝胶中电泳，电压120V，电泳30m in。凝胶成像分析系统观察记录结果。

1.3 测序及分析

由百泰克公司使用A BI3730X L测序仪对PCR扩增产物进行测序。测序果用Bioed it软件进行分析，与Gen Ban k序列（AC_000021）对比，在PUBMED网上进行氨基酸序列比对，确定是否为突变。

2 结果

2.1 细胞色素氧化酶-Ⅱ PCR扩增产物结果，见图1。

2.2 细胞色素氧化酶-Ⅱ测序结果统计

见表1。20例乳腺癌患者癌组织中共有4例m tDNA细胞色素氧化酶-Ⅱ区存在突变，突变率为20%。癌旁组织中共有2例m tDNA细胞色素氧化酶-Ⅱ区存在突变，突变率为10%。在20例乳腺癌组织中共有4个位点发生了突变，其中引起编码氨基酸改变的突变有1个。

3 讨论

肿瘤是多因素多步骤发展的产物，各种致癌物既然能有效地作用于m tDNA引起其产生与肿瘤相关的遗传改变，那么m tDNA在肿瘤细胞中的生物学意义必将得到重视。因此，深入研究肿瘤细胞m tDNA的结构及表达调控变化，探讨m tDNA突变与肿瘤的关系，对阐明细胞的癌变机制具有重要意义。目前已知多种肿瘤与m tDNA的突变有关，但对于它们的研究还只处于起步阶段，还没有得到m tDNA与细胞癌变直接相关的证据[1]。但有研究表明在小鼠癌细胞系中使用胞质杂交技术代替内生的m tDNA，结果显示m tDNA突变能够通过提高癌细胞的转移能力促进肿瘤的发生[2]。

表1 20例乳腺癌组织和癌旁组织中细胞色素氧化酶-Ⅱ突变情况

图1 乳腺癌组织细胞色素氧化酶-Ⅱ PCR扩增产物电泳图

m tDNA突变已在多种人类恶性肿瘤中被证实，m tDNA自身的易受损性和组成性的氧化压力使其缺陷成为恶性细胞的重要特征之一。但是，目前人们研究D-Loop区突变的比较多。本研究侧重于研究细胞色素氧化酶-Ⅱ区突变，国内鲜有报道。

细胞色素氧化酶-Ⅱ是细胞色素氧化酶的活性中心，是细胞色素C电子传递的入口，也是细胞色素氧化酶电子泄露产生活性氧的主要部位，因此保持细胞色素氧化酶-Ⅱ的正常结构和功能对于维持正常的线粒体功能和细胞能量代谢具有重要作用。细胞色素氧化酶基因的突变不仅导致突变部位附近残基的侧链结构环境发生极大的变化（包括电荷性质、亲疏水性质和空间特性），直接影响了酶复合物的形成，而且该酶几个亚单位之间相互作用区域受到了影响，整个酶分子的稳定性大大下降[3]。大量证据表明，细胞色素C从线粒体释放至胞质是引发凋亡的关键步骤。凋亡过程中细胞色素C的释放是线粒体外膜通透性增高的结果[4]。线粒体在凋亡过程中起中心控制作用，而细胞色素C的释放则是支配细胞命运的关键因素。有关这一信号途径及其相关事件的认识，对进一步了解凋亡的正常生理和病理过程，及其在肿瘤中的失调控具有重要意义。

我们的研究在乳腺癌患者中细胞色素氧化酶-Ⅱ基因突变率为20%，说明了在乳腺癌发生发展中线粒体细胞色素氧化酶-Ⅱ基因突变与乳腺癌的发生发展有关系。这些改变中，究竟哪些是多态性，哪些是与疾病相关的突变目前尚不清楚。这种突变的意义是正常多态性还是与乳腺癌密切相关尚不清楚，结合文献我们认为，突变导致编码氨基酸的改变可能引起线粒体功能异常，从而对乳腺癌的发病产生一定影响。虽然根据我们的结果尚不能认为m tDNA突变在乳腺癌发病中起决定性的作用，但m tDNA突变可能是发病过程中的一个前期或伴随现象，即这种突变可能在乳腺癌的发病前就存在于体细胞线粒体，提高了发生乳腺癌的易感性。

在我们研究的乳腺癌组织中同样有胞质异质性：线粒体几乎存在于人体的所有细胞中，每个细胞中含有成百上千个线粒体，因此部分细胞在连续分裂过程中发生有丝分裂遗传演变而导致组织中同时存在含野生型和突变型的两种细胞，这种状态称为线粒体的胞质异质性。线粒体异质性是乳腺癌患者的一种较为普遍的现象。谭氏等研究发现在乳腺癌组织中约半数体细胞性突变处于异质状态，其原因考虑有两个方面：其一，由于在肿瘤标本取材过程中受到正常细胞的少量“污染”，在随后的反应中使得“污染”得到数万倍的扩增，因此，测序结果显示为异质状态。其二，已观察到的异质性与肿瘤发生学上进展特征相同，可能代表着肿瘤的真实现象，而非污染所致。提示分子水平的改变发生在大体形态学变化之前，肿瘤发生是一个渐进的过程。

乳腺癌中m tDNA突变是比较普遍的，m tDNA突变可能是诱导核DNA突变的内源性因素之一。m tDNA突变可能会通过影响呼吸链的合成和核DNA与m tDNA基因相互调控，使核基因突变几率增大以及引起细胞凋亡紊乱，对乳腺癌发生和发展可能起着比较重要的作用[5]。

总之，中国人乳腺癌中m tDNA突变是一个普遍的现象，它们在肿瘤的发生、发展过程中可能起着重要的作用。细胞色素氧化酶在人体内分布十分广泛，它的突变与人类疾病发生有密切的关系，虽然检测乳腺癌患者线粒体DNA编码细胞色素氧化酶-Ⅱ基因的突变情况，但是突变位点氨基酸序列的改变、多肽疏水性的变化、蛋白质空间构想的改变等，还有很多问题仍需要进一步研究。

[1]张淑萍,宋书娟,李雅轩.人类线粒体DNA突变与癌症[J].遗传,2008,30（3）：263-268.

[2]Ishikawa K,Takenaqa K,Akimoto M,et al.ROS generating mitochondrial DNA mutations can regulate tumor cell metastasis[J]. Science,2008,320（5876）：661-664.

[3]蔡黔,周红,徐淑芬,等.过氧化氢导致线粒体DNA编码细胞色素C氧化酶基因突变与其编码蛋白结构与功能关系的研究[J].中国现代医学杂志,2004,14（1）：60-68.

[4]李娜,高俊岩,刘敏.细胞凋亡和肿瘤的关系研究进展[J].当代医学,2009,15（16）：13-14.

[5]石枫,曾健.线粒体DNA突变与乳腺癌关系的研究进展[J].广西医学,2007,29（6）：856-858.