猪传染性胸膜肺炎疫苗的研究进展

喻明成，汤德元，李春燕，王 凤，王 彬，张晓杰，甘振磊

（1.贵州省开阳县草地生态畜牧业发展中心，贵州 开阳 550300，2.贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025）

猪传染性胸膜肺炎(porcine contagious pleuropneumonia，PCP)是由胸膜肺炎放线杆菌(actinobacillus pleuropneumoniae，APP)引起的高度接触性呼吸道疾病。该病主要以肺出血、坏死和纤维素性渗出为病变特征。可致各年龄段的猪发生急性和慢性感染，常与巴氏杆菌等混合感染。临床特征为：病猪发热(体温可达42 ℃)，食欲不振，呼吸困难，后期呈犬坐姿势、张口伸舌、咳喘、腹式呼吸。耳、鼻、眼及后躯皮肤发绀；剖检可见纤维素性胸膜肺炎，尤其是肺两侧，65%的肺叶病变严重；发病率和死亡率常在20%以上，最急性型的死亡率可高达80%～100%；慢性型猪传染性膜肺炎放线杆菌潜伏于猪体内，可使猪只生长缓慢，平均日增重下降，饲养报酬降低，给养猪业造成巨大的经济损失。同时，急性感染耐过或阴性感染的猪只将是带菌者，成为本病再次暴发和流行的潜在传染源，是本病防控和根除的隐患。另外，感染APP后的仔猪，由于胸椎间脓肿压迫脊髓而引起后躯麻痹。

由于胸膜肺炎放线杆菌血清型较多，不同地区和猪场流行的血清型不尽相同，我国流行的优势血清型主要是1、2、3和7型。各血清型之间很少有交叉免疫保护作用，在防治本病的工作中，药物防治容易产生耐药性且成本较高，控制后极易复发，而且细菌不断产生耐药性，大量使用抗生素还会导致药物残留，影响食品安全。因此，研制安全高效的疫苗对预防和控制该病具有十分重要的意义。本文主要针对有关猪传染性胸膜肺炎疫苗研究的进展进行综述。

1 灭活疫苗

是猪传染性胸膜肺炎的传统疫苗，一般是用当地分离的优势流行菌株进行培养，通过加热或福尔马林处理使细菌灭活后加入适当的佐剂研制而成。它的优点是安全、不存在散毒和造成新疫源的危险，也不会返祖返强，便于贮存和运输。目前，用于预防猪传染性胸膜肺炎的商品化疫苗大多是这种疫苗。逯忠新等以国内多发的APP血清1、3和7型强毒株作为制苗菌株，制成油佐剂三价灭活苗。经效力试验，对上述3种血清型强毒攻击的保护率分别为88.8%、88.8%和100%。经试验动物安全性检验及田间安全检验，除个别猪出现轻微体温反应及暂时减食外，无其他异常反应，表明该疫苗对猪的保护性及安全性良好。

尽管灭活苗在国内运用得非常广泛，但它有许多缺点：如需多次免疫且保护效果非常有限；由于APP血清型众多，灭活苗仅能给免疫猪提供针对同一血清型菌株感染的抵抗力，甚至同型间有时也不能提供完全的交叉保护等，这些缺点给免疫预防该病带来了极大的困难。因此，研究安全、新型和能提供有效交叉保护力的APP疫苗是预防和控制该病的重要手段。

2 弱毒疫苗

研究表明，绝大多数APP灭活苗只能降低由于APP感染所引起的死亡率，并不能完全排除菌体以及阻止慢性感染造成的肺部损伤。研究者发现，自然感染某一血清型APP并且耐过的猪只能抵抗该血清型APP的再次感染。这就提示人们研制APP弱毒疫苗来免疫猪，可能获得高效的保护。近20年来，人们对APP的弱毒疫苗进行了大量研究，取得了一定的研究进展。

2.1 荚膜缺失弱毒疫苗

Rosendal和Maclnnes(1990)将一株血清1型APP在体外传代70次，使其荚膜变薄，而其他成份如外膜蛋白、全菌蛋白、Apx毒素都未发生变化，结果荚膜变薄的菌株毒力减弱但仍具有一定的免疫效果。Inzana1993)用甲磺酸乙酯对APP进行诱变，得到荚膜完全消失的突变菌株，该突变菌株的LPS（脂多糖）、膜蛋白以及Apx毒素都和亲本株相同，但毒力却大为减弱。不仅如此，突变菌株免疫动物，可产生很好的保护力，用同型或异型的血清型APP对免疫动物进行攻毒，均不会出现临床症状。荚膜只有很弱的免疫保护性，但荚膜却为APP的毒力所必需。所以荚膜缺失的菌株在毒力减弱的同时，并不影响其保护力。然而Inzana采用化学方法使荚膜缺失的菌株存在表型回复的可能，这是荚膜缺失弱毒疫苗一个潜在的安全问题。

2.2 毒素缺失弱毒疫苗

Bei等（2005)通过同源重组和蔗糖负向筛选系统，在血清7型APP的毒素ApxⅡC基因中插入绿荧光蛋白基因(GFP)使之失活，得到了一个不含抗性基因但能表达ApxⅡA的突变株。突变株的毒力在小鼠中大为降低，免疫小鼠后能对同型攻毒提供100%的保护，对异型攻毒提供70%的保护。Xu(2006)以血清10型APP为基础，插入氯霉素抗性基因同时缺失ApxlA基因编码C端的片段，构建了能够提供潜在的交叉保护的突变株。突变株分泌大约ApxI-N端48 ku的蛋白，失去了溶血活性，在小鼠中的毒力大为降低。该突变株免疫猪后，以异源血清9型APP攻毒，在临床症状、肺损伤上能提供一定的交叉保护。Lin(2007)以血清1型APP分离株为亲本菌株，通过同源重组和负向筛选的方法分步缺失了ApxI和ApxⅡ的激活因子ApxⅠC和ApxⅡC，构建不含抗性标记的APP双基因缺失株，该突变株毒力低，免疫原性好，免疫动物可对同源血清1型APP和异源血清9型APP的攻击提供有效保护。同时，该研究还比较了鼻腔接种和肌肉注射2种免疫方式效果，结果鼻腔接种效果明显优于肌肉注射免疫。

2.3 温度敏感型弱毒疫苗

Byrd和Hooke(1997)用亚硝基胍诱变、青霉素和环丝氨酸富集的方法，筛选了血清1型APP温度敏感型弱毒菌株，其生化特性、LPS（脂多糖）、外膜蛋白和Apx毒素都与亲本菌株相同，但在37 ℃的条件下，细菌复制1～3代就会死亡。用温敏突变株通过鼻内免疫小鼠，对5×LD50的亲本菌株攻击具有部分保护力。与先前Inzana(1993)研制的荚膜突变株比较，该突变株毒力更低，反强危险也相对较低。但是，该突变株仍然具有反强可能，暂时不能作为疫苗开发，还需要进一步改造温敏突变株，使之能稳定遗传。Byrd还评价了荚膜、LPS、OMP（造骨牛奶蛋白）和毒素蛋白的抗体水平和保护性之间的关系。结果发现荚膜多糖和LPS的抗体水平和保护性不相关，抗体水平在不同的感染程度间没有区别，但毒素的抗体水平和保护性之间呈正相关，从而证明毒素的抗体水平在保护中起着极为重要的作用。

2.4 生物合成基因缺失弱毒疫苗

Fuller等(1996)通过缺失核黄素生物合成操纵子(ribGBAH)一部分基因后，用含有卡那霉素抗性基因表达盒来取代这部分基因，利用同源重组技术获得了核黄素合成酶突变株，该突变株与亲本菌株相比毒力明显降低，构建了APP第1个编码代谢物基因缺失的突变菌株，同时也是首次报道核黄素合成必需基因缺失后能够导致病菌的毒力降低，有望把它作为弱毒疫苗候选菌株进一步研究。随后他在2000年通过试验证实，将这种弱毒突变株以肌肉接种免疫动物可产生显著的免疫保护力，可以抵抗APP野毒的攻击。Ingham等(2002)利用插入失活，通过氨苄抗性基因表达盒的插入获得了aroQ(5烯醇丙酮莽草酸-3磷酸合酶)失活的血清l型APP致弱株，由于aroQ基因缺失株在体内的生存能力较差，其在动物体内的毒力也就大大降低。通过质粒互补试验可以恢复突变株在体内的生存能力，故该突变株有望发展成为一个细菌疫苗载体，表达其他猪呼吸道疾病的免疫源性基因。

2.5 多基因缺失弱毒疫苗

随着研究的深入开展，人们对弱毒疫苗的要求也越来越高。由于APP毒力因子众多，所以多个毒力因子缺失的突变株显然比单基因突变株的毒力要降低得更多，而且发生回复突变的可能性也更小。因此，多基因突变的弱毒疫苗是当前疫苗发展的方向。Oswald等(1999)发展了一种有效定点突变系统，可以把不含标记的缺失基因引入到APP中。通过这种方法，构建了脲酶基因(ureC)和与铁摄取相关的基因(exb)的突变株。这种方法也使在APP中构建多基因缺失突变株成为可能。Maas等(2006)在Tonpitak(2002)构建的血清2型APP弱毒株的基础上，继续缺失了一系列的毒力相关因子，包括3个与厌氧呼吸相关的酶类dmsA，hybB，aspA和铁摄取调节基因fur，得到了高度致弱的6基因缺失株。该6基因缺失株可以在下呼吸道克隆并诱导出可检测免疫应答，免疫动物后产生了对异源血清9型APP攻击的有效保护。最重要的是，由于apxⅡA基因的缺失，该疫苗还可以用ApxⅡA-ELISA鉴别区分自然感染动物和疫苗免疫动物，因而可用作鉴别诊断。

利用现代分子生物学技术和基因工程方法，研究不含抗生素标记基因、可以区分自然感染猪和疫苗免疫猪、低毒力或无毒力的APP基因工程活疫苗菌株并研制成疫苗，是弱毒疫苗研究的一个发展方向，已成为目前控制猪传染性胸膜肺炎疫苗研究的热点领域。然而，对于APP的致病机制，至今也未能得到完全阐述，所以获得绝对低毒菌株、高效保存方法和便捷接种途径等难题仍然困扰着人们，由此可见APP的弱毒疫苗的研究任重而道远。

3 亚单位疫苗

随着对APP毒力因子致病性和免疫原性的研究不断深入，人们认为全菌体灭活疫苗保护力不够是因为这种疫苗不包含APP生长过程中分泌到外界的一些毒力因子，特别是Apx毒素，因而开始着手研究与毒力因子相关的亚单位疫苗，以期提高疫苗的保护效果。如用一些与致病有关的蛋白如荚膜、外膜蛋白、溶血素以及多种免疫原的混合物来制备亚单位苗。研究发现将APP的2种或2种以上的毒力因子混合，如荚膜多糖与脂多糖、转铁结合蛋白与脂蛋白、ApxⅠ与ApxⅡ、ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ与OMP等进行免疫攻毒保护试验均获得有效的保护。

Rapp等(1986)研究表明，用富含外膜脂蛋白的制剂(OmlA)免疫动物后，对同种血清型APP的感染，具有一定的保护力。Chiang等(1991)发现用蛋白酶-K处理后的外膜蛋白免疫动物，保护效果更好。Devenish等(1990)研究发现，110 ku的溶血素是一种重要的免疫原，刺激机体产生的抗体水平和保护力呈正相关。其后Fedorka-Cray(1990)的研究表明，血清1型APP的细胞抽提物的保护力比灭活苗和外膜脂蛋白的制剂更好。他推测，OmlA与细胞抽提物联合免疫动物，将会产生更好的保护力。Fedorka-Cray等1993年进一步研究了细胞抽提物(主要成分为ApxI和ApxII)的保护效果，并和4种灭活疫苗免疫效果进行了对比试验，结果显示细胞抽提物可以显著降低肺部病变率和阻止死亡，认为这种细胞抽提物包含可以完全保护同型菌攻击发病和死亡的物质。

Maas等(2006)发展了一种可以用于鉴别诊断的亚单位疫苗(DIVA)，它结合了先前研究的优点，在铁离子限制条件下培养用血清l、2和5型APP apxⅡA缺失体，取细胞抽提物乳化，包含主要的膜蛋白和分泌性蛋白。以同源血清2型APP攻毒，免疫组没有表现胸膜肺炎临床症状，细菌分离率也显著低于对照组。以异源血清9型菌APP攻毒，免疫组肺组织没有损伤，仅有2头(共10头)猪的肺组织可分离到少量的攻毒菌株。免疫组不产生针对ApxⅡA的抗体。因此，该疫苗免疫动物可以和野毒感染动物区分。该结果表明，多种表面抗原的抗体是产生良好交叉保护的原因，而单一的重组蛋白或仅含毒素加外膜蛋白的亚单位疫苗免疫效果很有限，无法阻止细菌定殖和肺部病灶形成。

以上研究表明，Apx毒素对于异源血清型APP的攻击是很重要的一种毒力因子，但是它并不是提供免疫力唯一毒力因子，因为仅仅含有Apx毒素的亚单位疫苗也只能提供部分保护。同时亚单位疫苗需要多次注射，通过物理和化学方法提取、纯化和制备亚单位疫苗成本高，价格昂贵。但它的最大优点是使用时不必检测患猪的血清型，可以在全世界通用。

4 Ghosts疫苗

灭活疫苗作为一种“死”苗，虽然具有最好的安全性。但由于在灭活过程中，某些抗原的免疫原性会遭到破坏，影响其免疫保护效果。近年来，APP的一种新的“死”苗—Ghosts疫苗的研究引起很多人的兴趣。这种疫苗实际上是细菌的空壳，它是利用噬菌体ΦXl74的E基因在革兰氏阴性菌(包括大肠杆菌、肺炎杆菌、霍乱弧菌、沙门氏菌、胸膜肺炎放线杆菌)中表达后，在菌体上形成一个通道，使细菌的DNA及细胞质都流失到体外，最终引起细菌的裂解失活而制备的一种疫苗。通过控制噬菌体ΦXl74的E基因表达来生产整个菌体衣壳，该方法制备的疫苗由于在制作过程中没有经过剧烈的物理或化学灭活过程。这些空的菌体衣壳具有与活细菌功能一样的抗原决定簇，从而具备良好的免疫原性，可以诱导产生较好的免疫保护效果。

Jalava等认为：Ghosts疫苗利用细胞膜定向载体，可把外源基因定向黏附到细胞膜上，可作为重组疫苗或多价疫苗的载体，而且插入的外源蛋白抗原决定簇基因不受大小的限制；Ghosts疫苗可以大量生产，且价格低廉；重组体Ghosts疫苗储存方便，能长期常温保存。对实验动物进行腹腔内、皮下、肌肉注射均可以激发特异的体液和细胞免疫应答；Ghosts疫苗成份，如肽聚糖也可作为天然免疫佐剂，外源靶蛋白与Ghosts疫苗混合后，Ghosts疫苗的组分对靶蛋白似乎有着优于明矾和完全弗氏佐剂的佐剂效应。但是，Ghosts疫苗仍然存在灭活不彻底的缺点，需要克服后才能在生产中应用。

不同动物中的免疫分析表明，该疫苗不仅可激发体液免疫应答，还可激发细胞免疫应答。但该疫苗作为一种“死”苗，同灭活疫苗一样同样缺乏菌体在生产过程中分泌的外毒素，而外毒素在交叉免疫保护中的重要作用已经得到证实。因此，其在交叉保护方面可能受到一定的影响。

5 口服疫苗

目前APP的疫苗一般是采用肌肉注射的方法进行免疫。免疫接种操作困难，而且肌注普通的细菌灭活苗往往对注射部位造成损伤，易引起猪群紧张，伴随炎症反应、机体发热等副作用，特别是对于仔猪往往造成很大伤害。研究发现，与其他呼吸道病原菌一样，APP也是通过黏膜侵入宿主。研究表明使用口服疫苗能够诱导很高的免疫反应，当第2次免疫时加大l0倍的剂量，动物能够克服免疫耐受，维持很高水平的全身免疫。于是人们开始尝试开发一种能诱导黏膜免疫反应的APP口服疫苗。

微胶囊技术是当今发展迅速、用途广泛的一种技术。它是将固体、液体或气体包裹在一个微小的胶囊中，形成微胶囊的物质。由于与外界环境隔离，可以免受外界环境的影响而保持稳定，在适当条件下，被包封物质又可以释放出来。Liao等(2001)利用乙基纤维素包覆技术，将灭活后血清1型APP包覆于微胶囊中，将这种肠溶性微胶囊口服疫苗以灌胃方式接种小鼠，然后进行抗体检测，发现小肠产生了很高的黏膜IgA抗体，但与灭活苗相比，口服肠溶性微胶囊疫苗产生的IgG抗体较低。随后Liao等(2003)利用猪和小鼠对这种疫苗的保护性作了进一步研究，并与普通的全细菌灭活苗进行对比，发现调整免疫剂量和时间后，微胶囊口服疫苗所产生的菌体抗体和黏膜IgA抗体均比全细菌灭活苗高，而且同型APP攻毒后产生的保护也比全细菌灭活苗好。因此，不断改进的微胶囊口服疫苗有望成为一种预防猪传染性胸膜肺炎的新型疫苗。

酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)是一种优良的表达系统，和大肠杆菌相比，表达的蛋白更接近天然蛋白而保持更好的免疫活性。Yoo等(2003)首先克隆了ApxⅡA基因并在酿酒酵母和烟草中表达，免疫小鼠后能对APP的攻毒提供一定的保护力，且抗ApxⅡA的免疫球蛋白IgA和IgG效价上升与免疫时的口服剂量呈正相关，这表明黏膜和体液免疫力可由口服疫苗诱导产生。同样，Shin等(2005)利用啤酒酵母系统表达了APP ApxⅡA蛋白后发展了一种口服疫苗。小鼠试验进一步证实，表达蛋白具有很好免疫原性；通过检测ApxⅡA特异性的IgA和IgG抗体，证实了这种口服疫苗可以诱导有效的黏膜和体液免疫反应。

6 核酸疫苗

核酸疫苗又称基因疫苗或DNA疫苗，是将一种或多种抗原编码基因克隆到真核表达载体上，以构建的重组质粒直接注入到体内而激活机体免疫系统。因此，也有人称之为DNA免疫。核酸疫苗作为一种新型疫苗在结核分枝杆菌有成功试验报道。贝为成等(2005)对胸膜肺炎放线杆菌的核酸疫苗进行了初步研究，构建了ApxⅡA的真核表达质粒，可以在PK-15细胞中表达ApxⅡA并具有良好免疫原性。以该质粒肌肉注射免疫Balb／C小鼠(近交系小鼠)，可以产生较高水平的ELISA抗体，初步证实用ApxⅡA作为核酸疫苗免疫动物可以激活机体免疫应答反应。

7 异源疫苗

异源疫苗是指利用不同微生物菌(毒)株，制备疫苗，接种后能使其获得对疫苗中不含有的病原体产生抵抗力，或是用同一种类病原中的一种型制备疫苗来抵抗另一型病原体，如火鸡疱疹病毒疫苗预防鸡马立克氏病，兔纤维瘤病毒疫苗能使其抵抗兔黏液瘤病毒。该方法制备疫苗的理论根据是:异源疫苗含有类属抗原，故能产生交叉免疫。另外，异源疫苗进入机体后，能迅速被消灭，散毒危险小，所以这类疫苗在实践中非常有意义。Lei等(2008)对APP血清l、5型(CCVC259，CCVC263)基因组进行分析研究，构建其基因文库，对血清1型6个候选疫苗蛋白基因和血清5型13个基因片段进行抗原性分析，发现其中的8个基因片段与短小棒状杆菌核苷酸同源性在77%～100%。采用短小棒状杆菌免疫小鼠后，用10×LD50的APP血清l、5型菌株分别进行攻毒试验，保护率分别达90%和95%。采用短小棒状杆菌免疫猪群，能够诱导猪群产生高水平抗APP的交叉反应血清抗体(滴度高达1∶6400)，同时免疫猪群可抵抗高剂量APP攻击。试验结果表明，APP与短小棒状杆菌之间存在共同抗原，这种交叉保护的重点在于使用短小棒状杆菌免疫接种可用于防治APP感染，成为防治APP的新型疫苗。

疫苗研制的最佳构想应该包括安全、有效、多价、成本低及保存和使用方便等，但猪传染性胸膜肺炎的疫苗要达到这一目标还需要一个漫长的过程。PCP疫苗的研究已经取得了一些可喜的进展，随着人们对病毒致病原认识的不断深入，研制的PCP疫苗也在不断完善，相信不久的将来科学家们会研制出特别有效的疫苗来控制PCP的发生。

（参考文献略）