谷氨酰胺对高氧肺损伤的干预效果观察

刘秀香,郭金将,赵国英,罗 瑶

(滨州医学院附属医院,山东滨州 256603)

目前,对于高氧肺损伤尚缺乏有效的防治措施。虽然临床上有应用糖皮质激素、抗氧化剂治疗等防治高氧肺损伤的报道,但这些方法仅能部分减轻肺损伤的程度,并不能完全阻止肺损伤的发生、发展,且激素等药物本身具有较多不良反应,临床应用需非常慎重。对机体来说,谷氨酰胺是一种条件性必需氨基酸。2009年 6月 1日 ～2010年 11月 21日,我们应用谷氨酰胺对高氧肺损伤的发生环节进行干预,观察干预效果,以探讨高氧肺损伤安全、有效的防治方法。

1 材料与方法

1.1 材料 将240只孕21 d(足月为22～23 d)的新生SD大鼠随机分为空气组(Ⅰ组)、空气+生理盐水(NS)组(Ⅱ组)、空气+小剂量谷氨酰胺组(Ⅲ组)、空气+大剂量谷氨酰胺组(Ⅳ组)及高氧模型组(Ⅴ组)、高氧+NS组(Ⅵ组)、高氧+小剂量谷氨酰胺组(Ⅶ组)、高氧+大剂量谷氨酰胺组(Ⅷ组)共8个组,各 30只。根据大鼠处死时间,每组又随机分为 3、7、14 d各 3个亚组。

1.2 方法

1.2.1 模型的建立 将Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组大鼠在普通空气中饲养;Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ组大鼠置于同一室的高浓度氧(＞95%)箱中饲养,箱内放置钠石灰以吸收大鼠呼出的CO2,使CO2浓度低于0.5%。Ⅲ、Ⅳ、Ⅶ、Ⅷ组大鼠以灌胃方式给予谷氨酰胺(大剂量组每天给予谷氨酰胺0.75 g/g,小剂量组谷氨酰胺给予大剂量组的 1/3,给药时间为生后第 1～7天),Ⅱ、Ⅵ组给予相应剂量的NS。每日清晨开箱1次,更换饲料、水、垫料,同时将空气组与高氧组的代母鼠互换以防止代母鼠氧中毒。

1.2.2 血标本采集及8-异前列腺素F2a检测 各组动物在相应时间点断头取血并处死,采集的血液置于EDTA抗凝管中,3 000 r/m in离心10 min,留取血浆,-80℃保存,同批酶联免疫法检测血浆8-异前列腺素 F2a。取大鼠左侧肺组织浸入 4%的甲醛中固定,24 h后石蜡包埋、切片、HE染色,光镜下观察。取大鼠右侧肺组织并置入 2.5%戊二醛中固定,电镜下观察。

1.2.3 统计学方法 采用SPSS11.5统计软件。数据比较用单因素方差分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠肺组织病理学变化 光镜观察：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组各时间点大鼠肺泡结构清晰、大小均匀一致。Ⅴ组 3 d可见肺泡腔内有红细胞和炎症细胞渗出;7 d肺泡腔仍有红细胞渗出,肺泡腔变大,肺泡壁变薄,有肺大疱形成;14 d肺泡大小不等,数量减少,肺泡间隔增厚。Ⅷ组 3、7 d红细胞渗出明显减少,14 d肺泡数量减少不明显,肺泡间隔无明显增厚。Ⅶ组 3、7 d肺泡腔出血略有减轻,14 d肺泡间隔增厚较V组略有减轻。

电镜观察：Ⅴ组 3 d肺泡Ⅱ型上皮细胞胞膜完整、胞质内板层小体出现排空现象、线粒体肿胀明显,肺泡I型细胞染色质分布不均、线粒体肿胀;7 d细胞超微结构改变较 3 d更为明显,Ⅱ型上皮细胞核染色质松弛、板层小体排空现象增加、线粒体肿胀更加明显,呈气球样变;14 d各种细胞仍有线粒体肿胀,肺泡Ⅱ型上皮细胞异染色质增加、出现核边集、板层小体基本排空,肺间质可见大量胶原纤维。Ⅷ组 3、7 d各类细胞线粒体肿胀明显减轻,肺泡Ⅱ型上皮细胞板层小体排空明显减轻,未见肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡或死亡现象;14 d肺间质胶原纤维未见明显增加。Ⅶ组各类细胞在各时间点的变化较Ⅴ组略轻。

2.2 各组大鼠血浆8-异前列腺素F2a检测结果见表1。由表 1可见,Ⅴ组血浆 8-异前列腺素F2a水平从第 3天即开始升高,第 14天最高;Ⅷ组各时点血浆8-异前列腺素F2a水平较Ⅴ组明显降低,但仍高于Ⅰ组;Ⅶ组血浆8-异前列腺素F2a含量较Ⅴ组降低不明显。

表1 不同时间点各组大鼠血浆8-异前列腺素F2a水平比较(μg/L,±s)

表1 不同时间点各组大鼠血浆8-异前列腺素F2a水平比较(μg/L,±s)

注：与Ⅰ组同一时间点相比,＊P＜0.05;与同组前一时间点相比,△P＜0.05;与Ⅴ组同一时间点相比,#P＜0.05

3 讨论

目前,高氧肺损伤的发病机制尚未阐明,更缺乏有效的干预措施。研究表明,正常情况下,机体内有氧自由基产生,同时也有抗氧自由基的防护系统,这两者处于平衡状态。在高氧环境中,这种平衡被打破[1],氧自由基大量产生,在某些氧化应激产物,如8-异前列腺素F2a及炎症细胞因子(如TNF-α等)作用下,细胞膜的完整性遭到破坏,细胞能量代谢发生障碍,细胞器功能受限,细胞水肿,出现凋亡或坏死[2];同时肺组织表面活性蛋白等产生显著减少,而且细胞的再生和恢复缓慢,最终肺的功能受到影响。本研究结果亦显示,Ⅴ组细胞结构破坏明显。在高氧性肺损伤发病过程中,存在以下几个重要环节：①由氧自由基介导的炎症反应,产生大量的炎症介质和趋化因子;②炎症介质和趋化因子对组织细胞的破坏;③能量消耗,细胞功能障碍。若能阻断这三个环节,则可有效消除或减轻肺部炎症反应及肺组织损伤。

8-异前列腺素 F2a作为活性氧作用于多不饱和脂肪酸和脂类的终产物,在机体、血、尿等体液和组织中极其稳定,不受食物和药物等因素的影响,检测样本可长期保存而不影响检测结果,其水平可以特异、准确反映体内氧化应激导致的脂质过氧化损伤作用[3,4]。本研究结果显示,Ⅴ组自第 3天起,血浆8-异前列腺素 F2a的水平持续高于各空气组,第14天达高峰。说明高氧情况下机体的过氧化代谢增强,这与某些研究显示的反映高氧肺损伤脂质过氧化的指标MDA变化情况相一致[5]。

谷氨酰胺虽然不是一种必需氨基酸,但因为它与机体的多种重要代谢反应息息相关,所以被认为是条件性必需氨基酸。人体在各种创伤、感染等应激状态下,谷氨酰胺的需要量大大增加。近年的研究显示,谷氨酰胺可以减轻脓毒血症、内毒素血症引起的肺损伤,作用机理是谷氨酰胺可以增加热休克蛋白70(HSP70)的表达,并且可以减少一氧化氮(NO)及NF-κB等炎性细胞因子的产生[6]。此外,谷氨酰胺可以弱化细胞死亡和诱生型一氧化氮合酶的表达[7],增加细胞外和纹状体中 γ-氨基丁酸的含量[8]。由此推测,谷氨酰胺可能通过对抗氧自由基、减少炎症细胞因子的产生及释放,并通过提供有效的能源而促进细胞功能恢复,预防慢性肺损伤的发生。

[1]Pace PW,Yao LJ,Wilson JX,et al.The effects of hyperoxia exposure on lung function and pulmonary surfactant in a ratmodel of acute lung injury[J].Exp Lung Res,2009,35(5)：380-398.

[2]Rokach J,Khanapure SP,Hwang SW,et al.The isoprostanes：a perspective[J].Prostaglandins,1997,54(6)：823-851.

[3]Eriksson O.Inhibition of lipid peroxidation in isolated rar liverm itochondria by the general anaesthetic propofol[J].Biochem Pharmacol,1992,44(2)：391-393.

[4]Aruoma OI,Halliwell B,Hoey BM,etal.Theantioxidant action of N-acetylcysteine：its reaction with hydrogen peroxide,hydroxyl radical,superoxide,and hypochlorous acid[J].Free Radic Biol Med, 1989,6(6)：593-597.

[5]刘雪雁,吴捷,薛辛东.高氧致新生鼠肺损伤时肾组织一氧化氮及氧自由基的变化[J].中国当代儿科杂志,2005,7(1)：71-74.

[6]Peng ZY,Hamiel CR,Baneriee A,et al.Glutam ine attenuation of cell death and inducible nitric oxide synthase expression following inflammatory cytokine-induced injury is dependent on heat shock factor-1 expression[J].Jpen J Parenter Enteral Nutr,2006,30 (5)：400-406.

[7]Singleton KD,Beckey VE,WischmeyerPE.Glutam ine prevents activation of NF-κB and stress kinase pathways,attenuates inflammatory cytokine release,and preventsacute respiratory distress syndrome (ARDS)following sepsis[J].Shock,2005,24(6)：583-589.

[8]Wang L,Maher TJ,Wurtman RJ.Oral L-glutamine increases GABA levels in striatal tissue and extracellular fluid[J].FASEB J, 2007,21(4)：1227-1232.