p38MAPK抑制剂CBS3830对糖尿病大鼠自体静脉移植内膜增生的影响及机制探讨

邬 松,葛建军,赵智伟,刘永志,周经月

(安徽医科大学第一附属医院,合肥 230022)

糖尿病(DM)患者70%～80%死于心血管系统并发症[1],其中 3/4死于冠状动脉疾病[2],且大多为 2～3支冠脉受累。利用自体静脉行冠状动脉旁路移植术(CABG)是治疗冠状动脉多支病变的常用方法,但术后静脉桥狭窄率较高。p38MAPK是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)超家族的新成员,参与多种细胞的胞内信号传递。研究发现,p38MAPK信号传导通路与静脉桥狭窄的发生密切相关。2009年11月 ～2010年 6月,我们建立糖尿病大鼠自体静脉移植模型,观察p38MAPK抑制剂CBS3830对大鼠自体移植静脉内膜增生的影响,并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 材料 SPF级SD大鼠30只,均为雄性,体质量200～250 g,6～8周龄。CBS3830及其溶媒1%甲基纤维素,链脲佐菌素(STZ)。大鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)ELISA试剂盒,HE染色试剂盒。

1.2 方法

1.2.1 大鼠糖尿病模型的建立 30只大鼠禁食(不禁水)18 h,将STZ溶于0.1mol/L柠檬酸缓冲液(pH 4.4),行腹腔注射60 mg/kg;72 h后尾静脉采血,用血糖仪测定血糖,血糖＞16.7 mmol/L为造模成功。26只大鼠成模,其余大鼠剔除。

1.2.2 动物分组及处理 糖尿病大鼠随机分为对照组及药物组,各13只,采用改良cuff法将右颈外静脉连接于同侧颈总动脉之间,建立自体静脉移植模型[3]。造模前1 h药物组经胃管灌入0.3 mg/m l的CBS3830 1m l/100 g,对照组同法给予等体积的CBS3830溶媒1%甲基纤维素。术后分笼饲养,喂标准食物,自由饮水,不用胰岛素。

1.2.3 血清TNF-α检测方法 分别于术前及术后1、3、7 d从大鼠眼球后静脉采血,离心后取血清备用。采用ELSIA法测定血清TNF-α,严格按照试剂盒说明书操作。

1.2.4 大鼠移植静脉内膜增生情况观察 术后 1周处死动物,用4%中性甲醛在体固定移植静脉;取出移植静脉继续用甲醛固定24 h,常规石蜡包埋,切片厚约 5μm,按参考文献[4]的方法行 HE染色,采用计算机图像分析系统采集图像。每个标本随机取5处不连续的位置,测量内膜及中膜厚度,计算内膜厚度/中膜厚度,取均值。

1.2.5 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件。计量资料比较用独立样本 t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组大鼠各时点血清TNF-α水平比较 见表1。

表1 两组大鼠各时点血清TNF-α水平比较(ng/L,±s)

表1 两组大鼠各时点血清TNF-α水平比较(ng/L,±s)

注：与对照组相比,＊P＜0.05

TNF-α组别 术前 术后1 d 3 d 7 d对照组 214.84±12.90 202.45±20.59 233.07±20.28 240.70±42.68药物组 204.35±19.87 208.57±20.09 227.36±29.46 176.18±19.68＊

2.2 两组大鼠移植静脉内膜及中膜厚度、内膜厚度/中膜厚度比较 见表2。

3 讨论

p38MAPK是MAPK家族成员之一,紫外线、热休克、渗透压、牵张、剪切力、缺血再灌注、氧化应激以及IL-1、TNF-α等炎症因子均可激活细胞的p38MAPK。p38MAPK被磷酸化激活后进入细胞核内或转移到其他部位,发挥对应激条件下的细胞免疫调节、炎症反应及对细胞生长、分化、增殖和凋亡过程的调控。因此,p38MAPK被认为是细胞信息传递的交汇点或共同通路。

表2 两组大鼠移植静脉内膜厚度及内膜厚度/中膜厚度比较(±s)

表2 两组大鼠移植静脉内膜厚度及内膜厚度/中膜厚度比较(±s)

注：与对照组相比,＊P＜0.05

组别 n 内膜厚度(μm) 内膜厚度/中膜厚度对照组 13 38.5±1.50 1.70±0.12药物组 13 33.6±1.34＊ 1.23±0.08＊

冠心病是糖尿病的血管并发症之一,CABG是其主要的治疗方法,大隐静脉是使用最多的移植血管,但术后第1年即有12%～20%的移植血管发生阻塞,此后每年再有 4%的血管出现阻塞。移植血管发生阻塞的机制可能有以下几方面：①手术创伤可导致静脉内皮细胞损伤,使血管内胶原纤维暴露而激活p38MAPK;p38MAPK激活后能产生血栓素,引发血小板聚集,从而导致移植血管闭塞。同时,手术创伤亦可引起炎性细胞因子TNF-α等释放,也可活化p38MAPK,而活化的p38MAPK又可通过正反馈机制加强TNF-α的表达,从而导致血管内膜的增厚。②糖尿病患者持续的高血糖可直接损坏血管内皮,且血脂异常及游离脂肪酸增加均可导致氧自由基增多,从而激活p38MAPK,促进单核巨噬细胞分泌大量的细胞因子(如TNF-α),参与移植血管内膜的增生;陈惠玲等[5]研究发现,平滑肌细胞接受不同浓度的H2O2刺激可激活p38 MAPK,从而促进平滑肌细胞凋亡,进而参与糖尿病血管并发症的发生。③糖基化终产物 AGE与细胞表面特异性受体相互作用,是导致糖尿病并发症的重要原因[6]。RAGE是近年来发现的一种细胞膜受体,主要分布于血管内皮细胞、血管平滑肌细胞及巨噬细胞等细胞表面。RAGE与其AGE结合可引起血管内皮损伤、细胞基质异常增生及血流动力学、血液流变学异常等改变[7～9],其信号传导是通过 AGE+RAGE→p38MAPK→NF-κB→细胞因子(如TNF-α)通路来实现的[10],进而参与移植血管内膜的增生。王欣等[11]研究发现,自体静脉移植的糖尿病大鼠血清中的AGE水平与移植血管内膜的增生呈正相关。④糖尿病患者体内的高渗透压同样可以激活p38MAPK,从而参与血管内膜的增生、生长及平滑肌细胞的增殖。

本研究显示,药物组血管内膜增生较对照组有明显减轻,TNF-α表达明显低于对照组。这提示p38MAPK抑制剂CBS3830对移植血管的内膜增生有抑制作用,与其降低 TNF-α表达有关。因此,阻断或调控MAPK信号转导途径的活性,有可能成为防治糖尿病患者CABG后移植血管内膜增生的有效靶点。但糖尿病患者CABG后移植血管的内膜增生是多因素作用的结果,具体机制复杂,有待进一步研究。

[1]钟学礼.临床糖尿病学[M].上海：上海科学技术出版社,1995：222.

[2]Herlitz J,Malmberg K.How to improve the cardiac prognosis for diadetes[J].Diebetes Care,1999,22(Suppl 2)：89-96.

[3]刘永志,葛建军.改良cuff法建立大鼠自体静脉移植动脉化模型[J].安徽医药,2010,14(5)：560-562.

[4]梁晓俐.病理学基础与实验技术[M].北京：军事医学科学出版社,2004：129-138.

[5]陈慧玲,廖兰.H2O2对平滑肌细胞凋亡及p38MAPK活性的影响[J].湖南医科大学学报,2002,27(5)：402-404.

[6]Stern DM,Yan SD,Yan SF,etal.Receptor for advanced glycation end products(RAGE)and the complicationsofdiabetes[J].Aging Res Rev,2002,1(1)：1-15.

[7]Ramasamy R,Vannucci SJ,Yan SS,et al.Advanced glycation end products and RAGE：a common thread in aging,diabetes, neurodegeneration,and inflammation[J].Glycobiology,2005,15 (7)：16-28.

[8]Ramasamy R,Yan SF,Schm idt AM.The RAGE axis and endothelial dysfunction：maladaptive roles in the diabetic vasculature and beyond[J].Trends Cardiovasc Med,2005,15(7)：237-243.

[9]Bierhaus A,Humpert PM,Stern DM,et al.Advanced glycation end product receptor-mediated cellular dysfunction[J].Ann NY Acad Sci,2005,1043(6)：676-680.

[10]Yeh CH,Sturgis L,Haidacher J,et al.Requirement for p38 and p44/p42m itogen-activated protein kinases in RAGE-mediated nuclear factor-kappaB transcriptional activation and cytokine secreti on[J].Diabetes,2001,50(6)：1495-1504.

[11]王欣,张强.糖尿病对大鼠自体移植静脉内膜增生的影响[J].中国普通外科杂志,2008,17(6)：560-565.