多抗原肽免疫血清体外阻断丙型肝炎病毒感染外周血单个核细胞的研究

闵 峰 王素美 黄文琪

据估计，全球丙型肝炎病毒（HCV）感染者达1.7亿人[1]。HCV感染人体后极易慢性化，且与肝硬化和肝癌的发生密切相关。HCV包膜糖蛋白高变区（hypervariable region，HVR）存在中和抗原表位，可诱导机体产生保护性抗体，能阻止HCV感染；另一方面，高变区呈高度变异，易发生抗原漂移，逃避机体的免疫监视，使感染慢性化。我们针对HCV高变区（HVR1:390～411aa）设计并合成了多抗原肽（MAP）序列，并用MAP免疫家兔后获得高效价的免疫血清，证实其具有良好的免疫原性[2]。本研究在建立HCV感染外周血单个核细胞的基础上[3]，用抗MAP血清在体外阻断HCV感染外周血单个核细胞，为研制HCV分子疫苗提供实验依据。

材料与方法

一、实验材料 取经RT-PCR法检测证实的HCV RNA阳性感染患者血清，采用ELISA法检测为抗HCV-IgG阳性，而其它肝炎病毒标志物均阴性，血清ALT正常；高效价兔抗MAP血清（1:40960）具有良好的免疫原性[2]，无菌采集血清、分装，冻存于-80℃冰箱。用前经56℃30min灭活补体；免疫组化试剂盒购自福州迈新生物技术开发公司；抗HCV NS5单克隆抗体由北京大学肝病研究所提供；原位杂交试剂：Dig标记的HCV正链寡核苷酸探针为参照Bukh等[4]的HCV5' 非 编 码 区 探 针 序 列 （-95～-56nt）5'-CT GCTAGCCGACTAGTGTTGGGTCCGCGAAACCGCTTGTGG-3'，由军事医学科学院二所制备和纯化；碱性磷酸酶标记的地高辛抗体、杂交液、封闭剂和NBT/BCIP溶液均为德国宝灵曼（Boehringer Manheim）公司产品；检测HCV RNA的RT-PCR试剂：引物由上海生物工程有限公司合成并纯化，由内引物扩增HCVcDNA，长度为474bp。裂解液Tripure为德国宝灵曼公司产品；逆转录酶（AMV）、RNA酶抑制剂（RNasin）、无 RNA 酶、Taq 酶、dNTP、MgCl2 等为美国Promega公司产品。

二、兔抗MAP血清体外阻断HCV感染 外周血单个核细胞的分离见参考文献[3]，即将分离的HCV RNA阳性者外周血单个核细胞，接种于25ml培养瓶，每瓶3ml或12孔培养板，每孔1ml，轻轻摇匀，置入37℃ 5%CO2培养箱中培养16～18h，弃去培养上清，用培养基反复冲洗3次，留取最后一次洗涤液待检。然后，再加入等体积新鲜完全培养液，每1～2天更换培养基，在培养过程中始终保持总体积不变。设感染组、阻断组和对照组。阻断组：取兔抗MAP血清，与血清HCV RNA阳性血清按照1:1、5:1和10:1比例混合，加入到正常人外周血单个核细胞。将生长良好的细胞加入12孔培养板中，每孔终体积为1ml，16～18h后，弃去培养上清，用培养基反复冲洗3次，留取最后一次洗涤液待检。然后，再加入等体积新鲜完全培养基，每1～2天更换培养基，在培养过程中始终保持总体积不变；兔对照组：取未经免疫的正常兔血清，与HCV RNA阳性者外周血单个核细胞按照1:1、5:1和10:1比例混合，其它过程同阻断组；人对照组：取正常人血清，与HCV RNA阳性者外周血单个核细胞按照1:1、5:1和10:1比例混合，其它过程同阻断组。

三、细胞或培养上清HCV RNA的检测 采用RT-PCR法。检测HCV正链RNA时，在逆转录体系中加入外引物负链，检测负链时加入外引物正链。第1次 PCR 循环参数为：94℃1min，54℃1min，72℃1min，35个循环；第2次PCR循环参数为：94℃1min，54℃30s，72℃1min，35个循环。由内引物扩增HCVcDNA长度为474bp。取PCR扩增液10μl，与1μl加样缓冲液（0.25%溴酚蓝，40%蔗糖）混合，上样于含溴化乙锭的2.0%琼脂糖凝胶，于1TAE缓冲液中，在5V/cm电压下电泳30～60min，紫外线灯下观察474bp处有荧光带者即为阳性。

四、外周血单个核细胞HCV NS3和NS5特异性抗原的检测 采用免疫组化和原位杂交法。具体操作过程参照《实用免疫细胞化学与核酸分子杂交技术》[5]及《非放射性杂交技术》[6]和试剂说明书。

结果

一、细胞和培养上清HCV RNA水平 在感染组细胞培养第3天，可检出细胞和上清液HCV RNA阳性，持续至第19天，而在按1:1血清混合阻断组第3天至第9天，可检出细胞和上清液HCV RNA阳性，而到第11天则未再检出，在5:1和10:1阻断组，细胞和上清中更快即检测不出HCV RNA；对照组的检测情况与感染组结果相似（表1和图1、图2）。在接种后第3～15天，感染组细胞内可见阳性的蓝紫色颗粒，呈胞浆型（图3），而在阻断组（5:1和10:1阻断），细胞内未见蓝紫色杂交信号。

图1 感染组和对照组细胞HCV RNA的检测

图2 阻断组（血清按1:1阻断）细胞HCV RNA的检测

图3 感染组细胞HCV RNA呈胞浆型表达（原位杂交，100×）

二、细胞HCV NS3和HCV NS5抗原的表达情况 在感染组和对照组，在接种后第3～15天细胞内可见HCV NS3和HCV NS5抗原呈胞浆型表达，未见胞核型表达，阳性细胞呈点状和散在分布，弥漫性分布少见；而在阻断组（5:1和10:1阻断），细胞内未见特异性抗原表达。

讨论

HCV感染机体后能否产生保护性免疫一直是人们争论的问题，也是HCV分子疫苗研究的难点和热点。研究表明，HCV包膜糖蛋白E2/NS1的HVR确实含有重要的B细胞线形表位，编码蛋白质能诱导机体产生保护性抗体[7～9]，但由于HVR1高度变异，易产生众多的突变株或准种，逃避机体先前产生的抗HVR1的识别，其抗HVR1部分或完全不具有中和作用。

HCV感染者血清中存在的抗HVR1或兔抗HVR1免疫血清能部分阻断HCV感染培养细胞[10，11]。本研究在感染细胞基础上[3]，用抗兔MAP血清与已感染外周血单个核细胞混合后接种培养，发现抗MAP血清能阻断细胞内和上清中HCV的继续感染[3]。

抗MAP血清对已感染的外周血单个核细胞有部分阻断作用，启示以此为基础继续筛选HVR1区中和抗原表位，结合HVR1区C端保守氨基酸位点，重新设计并合成多抗原肽，可为深入研究HCV分子疫苗提供思路。

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