肝复康对肝纤维化大鼠肝组织NF-κB、MMP-2和TIMP-2表达的影响*

张彩华 姜妙娜 李寒姝 袁丽君 赵赫男 李 骢 贾玉杰

肝纤维化是各种原因所致的反复肝损伤在组织修复过程中细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的构成改变和过度沉积的结果[1，2]。肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）是合成ECM的主要细胞，激活的HSC大量增殖，发生表型改变，转变为肌成纤维细胞（myofibroblast，MFB）并分泌过多的ECM沉积于肝脏[3～5]。核转录因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）是众多细胞因子和炎症介质表达的主要转录因子，是多种信号转导途径的汇聚点[6]。NF-κB不仅可以介导免疫应答和病毒复制，而且与HSC的激活密切相关[7，8]。中药肝复康是本室的研究验方，具有消炎、保护肝细胞、减轻ECM沉积和抑制HSC增殖的作用[9～11]。本研究探讨了肝复康对大鼠肝组织NF-κB和基质金属蛋白酶-2（MMP-2）表达的影响。

材料与方法

一、动物和试剂 清节级SD大鼠50只，雌雄不限，体质量180～220g，由本校实验动物中心提供[动物许可证号：SCXK（辽）2004-0017]。TrizolTM试剂盒（Invitrogen公司）；RT-PCR两步法试剂盒（北京天根）；兔抗NF-κBp65多克隆抗体（武汉博士德）。引物：设置β-actin为参照，由大连TAKARA公司合成，引物序列见表1。

表1 引物序列

二、中药的制备 肝复康由柴胡、当归（补血合血）、黄芪（益气）、赤芍、白芍（活血化瘀）、丹参（活血化瘀）等组成。其无菌原液由本校中西医结合研究所按既定的工艺制备（1.95g/mL）。

三、动物模型的制备与处理 SD大鼠50只，正常喂养1周后，被随机分为正常对照组（C）12只，模型组（M）7只，小剂量治疗组（LT）10只、中剂量治疗组（MT）11只和大剂量治疗组（HT）10只。造模动物给予橄榄油稀释的10%四氯化碳5ml.kg-1皮下注射，每周2次，共12周；正常对照组以同样方法皮下注射生理盐水。大、中和小剂量治疗组则于造模第9周后分别以 3125mg.kg-1.d-1、312.5 mg.kg-1.d-1和 31.25mg.kg-1.d-1（溶于10ml/kg生理盐水）肝复康灌胃至20周。于12周末处死模型组动物，其余各组大鼠于第20周末处死，迅速取出肝组织，称湿重。从肝右叶中部切取肝组织2块，一块用10%甲醛固定，制备石蜡切片；另一块置于-70℃冰箱保存，备检。

四、肝组织病理学检查 石蜡切片，常规HE染色。组织学评分标准如下[12]：0，肝组织结构正常，无增生和胶原纤维形成；1+，中央静脉周围少量的胶原纤维形成；2+，胶原纤维明显扩展，但无纤维间隔；3+，假小叶形成；4+，肝脏结构破坏明显，纤维间隔增厚，假小叶增多。

五、肝组织NF-κB水平检测 采用Weatern Blot法。组织蛋白的提取参照文献[13]，考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。取50μg蛋白上样进行SDS-PAGE，用5%浓缩胶和12%分离胶和Tris-甘氨酸电泳缓冲液电泳，电压20mA，PVDF膜进行半干式电转移40分钟。将膜放入5%脱脂奶粉中封闭3h，加入兔抗NF-κB p65多克隆抗体（工作浓度1:100，武汉博士德生物技术有限公司）4℃过夜，TBST漂洗10min×3，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔 IgG（1∶3000），37℃孵育 1h，TBST漂洗10min×3。采用化学发光法进行显色反应，重复3次，结果用光密度扫描仪记录。

六、肝组织 NF-κB、MMP-2和 TIMP-2 mRNA 水平的检测 采用RT-PCR法。提取RNA，合成cDNA，分别取NF-κB、MMP-2和 TIMP-2引物（20μmol/L）各0.5μL进行PCR扩增。取5μl扩增产物在TBE缓冲液中行1%琼脂糖凝胶电泳，使用凝胶成像仪拍照并进行图像分析。

七、统计学处理 应用SPSS12.0软件包进行统计学处理。所有数据均用表示，组间比较采用单因素方差分析，采用LSD法进行两两比较。采用Pearson法进行相关分析。P<0.05为差异有统计学意义，P<0.01为差异有显著性意义。

结果

一、肝复康对肝组织病理学的影响 模型组大鼠可见肝小叶结构紊乱，大量纤维组织增生，部分包绕分割肝细胞形成假小叶，肝细胞肿大，脂肪变性明显，部分有坏死（图1b）。与模型组相比，中剂量肝复康治疗组大鼠肝小叶结构明显改善，肝细胞水肿好转，脂肪变性明显改善，胶原纤维增生明显减轻，纤维间隔变细（图1c）。大、小剂量治疗组肝组织结构也有所改善，但效果较中剂量治疗组差。各组肝组织纤维化程度评分见表2。

图1 肝组织病理学变化（HE，×200）

表2 各组大鼠肝脏病理学评分

二、肝复康对NF-κB蛋白表达及mRNA水平的影响 模型组NF-κB蛋白表达明显升高，与正常组比有显著性差异（P<0.01）；中剂量治疗组NF-κB表达较模型组明显下降，差异有显著性（P<0.01）；大剂量治疗组和小剂量治疗组NF-κB表达与模型组比无明显差异（图2）；RT-PCR检测结果具有类似的变化趋势（图3）。

图2 NF-κB蛋白表达情况

图3 NF-κB mRNA水平

三、肝复康对MMP-2和TIMP-2mRNA水平的影响 正常对照组大鼠肝组织MMP-2和TIMP-2mRNA水平较低；在模型组大鼠肝组织，两者mRNA水平明显上调，与正常对照组比，有显著性差异（P＜0.01）；中剂量治疗组大鼠肝组织MMP-2和TIMP-2mRNA水平较模型组明显下调（P＜0.01），而与正常对照组比，差异无统计学意义（P＞0.05）；小剂量和大剂量治疗组大鼠肝组织MMP-2和TIMP-2mRNA水平较模型组也明显下调（P＜0.05，图 4，表 3）。

图4 MMP-2和TIMP-2mRNA水平

表3 各组MMP-2和TIMP-2 mRNA水平（光密度值）

四、NF-κB mRNA与 MMP-2和 TIMP-2 mRNA水平的相关性分析 见表4。

表4 各组MMP-2和TIMP-2与NF-κB mRNA水平的相关性分析

讨论

近年来，有学者用NF-κB抑制剂处理大鼠活化的HSCS，发现HSCS凋亡增多，提示NF-κB有抗HSCS凋亡的作用[14～16]。

我们的实验结果表明，肝复康治疗能够明显地抑制NF-κB的表达，其中中剂量治疗组的抑制效果最为明显。同时发现肝复康能减少NF-κB mRNA水平，从而抑制HSCS的增殖，减少炎症反应。

研究表明，维持ECM正常代谢的MMPS与TIMPS之间分泌失衡是导致多种组织纤维化的重要因素之一[17]。我们检测MMP-2和TIMP-2 mRNA水平，结果表明肝纤维化大鼠肝组织MMP-2和TIMP-2 mRNA水平较正常组明显增加，而与模型组比，肝复康治疗组大鼠肝组织MMP-2和TIMP-2 mRNA水平显著降低，说明肝复康同时也影响了MMP-2和TIMP-2的表达。

研究NF-κB信号通路与MMP-2和TIMP-2基因表达之间的关系表明，三者表达呈显著正相关（P＜0.05或P＜0.01）。因此，我们推测在肝纤维化发生过程中，NF-κB可能通过抑制HSCs的凋亡，从而增加MMP-2的表达，而MMP-2的过表达使TIMP-2表达也随之上调，但其中的分子生物学机制还有待于进一步研究。

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