慢性乙型肝炎患者HBV核心区与聚合酶区特异性CTL表位变异分析*

许智慧 任晓强 刘 妍 李晓东 王 耀 戴久增 徐东平

HBV感染引起的肝细胞病变主要由机体免疫反应引起，HBV特异性细胞毒性淋巴细胞（CTL）在清除细胞内感染病毒中起关键作用，同时也与肝组织的免疫病理损伤关系密切。CTL作用靶细胞是通过识别HLA-I类分子递呈的HBV抗原表位来实现，其对病毒的应答强度可能对乙型肝炎的进展产生重要影响。如果反应不足，病毒难以清除而使感染慢性化。如果反应过强，引起肝细胞广泛的严重损伤，从而使病情加重，严重者可造成肝衰竭[1]。中国人群中最常见的人类白细胞抗原（HLA-A）基因型是 HLA-A11、A2、A24及A33，已鉴定的HBV CTL表位主要为HLA-A2限制性，其他HLA-A限制性HBV CTL表位尚缺乏系统的研究[2]。我们以往的研究表明，急性乙型肝炎（AHB）较慢性乙型肝炎（CHB）患者HBV特异性 CTL反应强度高，HBV基因型对CTL表位有较大的影响。慢性重型乙型肝炎（chronic severe hepatitis B，CSHB）较CHB患者肝组织浸润的CD8+T淋巴细胞显著增高[3，4]。我们推测HBV特异性CTL表位变异与HBV感染的慢性化和重症化相关，但目前尚未见报道。本文对HLA-A2和A11阳性的AHB、CHB和CSHB患者HBV 核心蛋白（C）和多聚酶蛋白（Pol）中的特异性CTL表位变异进行了检测分析。

资料与方法

一、病例资料 2007年8月至2008年5月我院收治的516例乙型肝炎患者，247例为HLA-A2阳性，其中AHB 67例（男52例，女15例，平均年龄37.3±11.9岁），CHB 109例（男 93例，女 16例，平均年龄 39.7±11.5岁），CSHB 71例（男 55例，女16例，平均年龄48.6±12.4岁）；220例为HLA-A11阳性，其中AHB 67例（男54例，女13例，平均年龄37.9±10.7岁），CHB 107例（男92例，女15例，平均年龄39.3±13.7岁），CSHB 46例（男 40例，女 6例，平均年龄46.6±13.1岁）。其余49例患者为其他HLA-A基因型。诊断符合2000年西安会议制订的《病毒性肝炎防治方案》的标准[5]。

二、HLA-A分型 参照文献[6]报道的方法进行HLA-A2和HLA-A11分型鉴定。利用人淋巴细胞分离液分离患者外周血单个核细胞（PBMC），严格按照Qiagen DNA mini试剂盒（德国，Qiagen）说明提取患者PBMC基因组DNA，按照报道的SSP-PCR法设计合成特异性引物，进行PCR扩增，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，根据电泳条带确定HLA-A2分型。

三、HBV C区与Pol区基因扩增 采用DNAOUT试剂（四川，天泽公司），按照说明书提取血清HBV DNA。Pol基因（nt2307-1623）横跨了整个HBV基因组的80%，一次PCR虽然可获得其全部序列，但敏感性较差；为了提高Pol基因PCR扩增敏感性和获得全部C区序列，我们采用一管式巢式PCR[7]两片段拼接法。片段 1：HBV nt3194～1797（1818bp），包括全部的S基因序列和部分 Pol基因序列；片段 2：HBV nt1777～274（1712bp），包括全部的 C 基因序列和部分Pol基因序列，片段1与片段2有295bp的重叠部分，分别PCR得到片段1和片段2后，用DNAstar分析软件进行序列拼接，以获得完整的Pol基因序列。

片段 1： 第一轮 引物为：P1（上游）5’-AGTCAGGAAGACAGCCTACTCC-3’，P2（下游）5’-AAAAAGTTGCATGGTGCTGG-3’；第二轮引物为：P3（上游）5’-ATCCGCAGGCCATGCAGTGG-3’，P4（下游）5’-CCAATTTATGCCTACAGCCTC-3’。第一轮反应条件为：94℃ 3min；94℃ 45sec，59℃～51℃ 50sec（每2个循环减 2℃），72℃ 100sec，10个循环；94℃45sec，56℃ 50sec，72℃ 100sec，30个循环；72℃7min。第二轮反应条件为：94℃ 3min；94℃ 40sec，55℃ 45sec，72℃ 90sec，35 个循环；72℃ 7min。扩增片段长度为1818 bp。

片段 2：第一轮引物为：P1*（上游）5’-CTTGAGGCATACTTCAAAGAC-3’，P2* （下游）5’-TGAGGCATAGCAGCAGGATG-3’；第二轮引物为：P3*（上游）5’-GAGGCTGTAGGCATAAATTGG-3’，P4*（下游）5’-TGAGAGAAGTCCACCACGAG-3’。第一轮反应条件为：94℃ 3min；94℃ 40sec，59℃～51℃40sec（每 2个循环减 2℃），72℃ 80sec，10个循环；94℃ 40sec，56℃ 40sec，72℃ 80sec，30 个循环；72℃7min。第二轮反应条件为：94℃ 3min；94℃ 35sec，55℃ 35sec，72℃ 70sec，35 个循环；72℃ 7min。扩增片段长度为1712bp。

四、DNA序列分析 PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定和回收纯化后进行DNA序列测定，测序由北京利嘉泰成公司完成。测序引物为：片段1：P5（正向）5’-CATCCTGCTGCTATGCCTCA-3’；P6（反向）5’-AGAGGTTCCTTGAGCAGG-3’，P7（正向）5’-CCTATTGATTGGAAAGTATGTC-3’，P8 （正向）5’-GACGTCCTTTGTTTACGTCC-3’；片段 2：P9（正向）5’-GGTGTCTTTTGGAGTGTGGAT-3’；P10（反向）5’-AGGGAGTTCTTCTTCTAGG-3’，P11 （正向）5’-GTGGGTCACCATATTCTTGG-3’，P12（正向）5’-TTGGTGTCTTTTGGAGTGTG-3’。选择文献报道的4个HLA-A2限制性和1个HLA-A11限制性的C基因特异性CTL表位以及5个HLA-A2限制性的Pol基因特异性CTL表位序列做为参考序列，用Vector NTI软件对测定基因序列的推导氨基酸序列与参考序列进行比较。

五、HBV基因分型 根据所测定的HBV S基因序列，片段 1：在 HBV nt3194～1797 中 nt155～835 为 S基因序列。用ViursBlast软件做相似性计算和比较以进行基因分型。

六、统计学处理 应用SAS9.0软件对三组患者间各个表位变异的显著性差异进行卡方检验，P<0.05为具有差异显著，P<0.01为具有差异极显著。

结果

一、HLA-A2与HLA-A11分型的鉴定 见表1。

表1 3组患者HLA-A2/A11分型结果

二、CTL表位序列变异差异分析 在10个分析的CTL表位中检出了不同程度的变异，B型和C型HBV基因型对一些表位的变异有明显影响。AHB、CHB与 CSHB患者间A11:C88-96（YVNVNMGLK）表位变异发生频数有显著性差异（P<0.05，表2），而HLA-A2无显著性差异（数据未给出）。对三组间HBV B基因型患者进行比较时，A2:P455-463和A2:P816-824表位有极显著性差异（P<0.01，表3）；三组间HLA-A11 B基因型患者无显著性差异。对三组间HBV C基因型患者进行比较时，HLA-A2患者无显著性差异（数据未给出），而A11:C88-96表位有极显著性差异（P<0.01，表 2）。

表2 3组患者HLA-A11特异性CTL表位变异个数的比较

表3 3组B基因型患者HBV C蛋白和Pol蛋白HLA-A2特异性CTL表位变异（%）

三、CTL表位变异氨基酸分析 在多数变异表位中有多个氨基酸发生了替换，少数表位只有一个氨基酸发生改变，如C18-27、C115-124和P816-824表位。多数同一变异位点的替换氨基酸为同一种氨基酸（表4）。

表4 患者HBV C蛋白和Pol蛋白特异性CTL表位的主要变异氨基酸

讨论

HBV有8种基因型，我国主要以B基因型和C基因型为主，基因型对HBV感染的发病程度可能有一定的影响[8]。HBV C基因区编码的核心蛋白是组成病毒核衣壳的主要多肽，表达形式为HBcAg；C基因区相对保守，在持续HBeAg（+）/ALT正常的免疫耐受期和病毒感染20年以上都可能没有变异[9]。然而，C基因变异较常见于病变活动的慢性乙型肝炎[10]。Pol基因是最长的ORF，横跨了HBV整个基因组的80%，并且与其它3个ORF相重叠。Pol蛋白翻译起自HBV前基因组RNA，其产物为843个氨基酸的多功能蛋白。核心蛋白、外膜和多聚合酶蛋白都是Th和CTL细胞的靶抗原[11]。

HBV特异性CTL应答是机体清除肝细胞内HBV的关键因素。CTL通过识别和结合HBV抗原表位发挥作用。CTL表位由病毒蛋白中的短肽组成，并由HLA-I类分子递呈。CTL的特异性由T细胞受体决定，T细胞受体与HLA-I分子呈递的病毒表位间形成互补的空间结构而具有较高的亲和力，如果表位中氨基酸发生变异，则可以影响互补结构而降低与T细胞受体的亲和力。研究表明病毒的CTL表位变异可能是HBV逃逸免疫应答、引起乙型肝炎慢性化的重要机制[12]。一般认为HBV特异性CTL可以通过细胞裂解与非裂解两种方式清除感染病毒，但对影响CTL作用方式取向的因素和调节CTL反应强度的机制还未得到阐明。有研究表明，重型乙型肝炎患者外周血和肝组织中浸润的大量HBV特异性CTL细胞可通过释放的大量穿孔素和细胞因子导致肝细胞的大量死亡[13]。然而，另有研究表明，当HBV特异性CTL应答不能控制病毒复制时，可引起大量非特异性CTL浸润，是造成肝细胞病理损伤的主要原因[14]。因此，目前对HBV特异性CTL对乙型肝炎重症化的影响尚不明确。

通过对较大样本量的AHB、CHB和CSHB患者进行HBV核心蛋白和多聚合酶蛋白特异性CTL表位变异发生频率的比较，以了解HBV特异性CTL在乙型肝炎重症化发生中的作用。由于HBV特异性CTL表位的作用受HLA-A限制，同时某些表位在不同基因型间变异较大，我们在研究中首先通过HLA-A2和HLA-A11分型选择阳性患者，并通过S基因测序对患者HBV基因型进行了检测。结果显示，急性、慢性和慢性重型肝炎HLA-A2阳性患者，表位变异发生率无统计学差异；在三组HBV B基因型感染患者，P455-463和P816-824表位变异发生频率有极显著性差异；在三组间HBV C基因型患者，表位变异频数无统计学差异。在三组HLA-A11阳性患者，C88-96表位变异发生率有显著性差异；在三组A11阳性的HBV C基因型患者，C88-96表位变异发生频率有极显著性差异；在三组HBV B基因型患者，表位变异频率无统计学意义。值得注意的是，在三组患者之间有的CTL表位变异率增高，有的则降低，提示各个表位在乙型肝炎病毒诱导的机体CTL免疫应答中的作用有所不同。文献报道和我们以往的研究结果也发现在不同患者针对各个HBV抗原表位的CTL频率和反应强度并不一致。

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