河南汉族人群肿瘤坏死因子基因单核苷酸多态性检测*

胡 灏,董献红,黄艳梅#,郭利伟,赵美乐,李 聪,王晓丹

1)新乡医学院基础医学院法医物证学教研室新乡 453003 2)河南正诚法医临床司法鉴定所郑州 450008 3)河南省高级人民法院司法技术处 郑州 450008

#通讯作者,女,1971年5月生,博士,副教授,研究方向:人类遗传学,E-mail:hym_cn@hotmail.com

肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)是人体内一种促炎细胞因子,具有广泛的生物学活性。TNF基因单核苷酸多态性(single nucleotidepolymorphism,SNP)与疾病发生的关联性已见报道[1-5],且有部分正常群体TNF基因SNPs等位基因频率和家系的资料[3,6-7]。作者以河南汉族群体为研究对象,选择TNF-α基因启动子区-238G→A(rs1800629)、-308G→A(rs361525)、-850C→T、-857C→T (rs1799724)、-863C→A(rs1800630)和TNF-β基因第一内含子 +252G→A(rs909253)共 6个位点[2-5],应用PCR-限制性片段长度多态性技术(PCR and restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)检测这6个SNPs位点等位基因分布频率,并探讨其在法医学应用中的价值。

1 对象与方法

1.1 研究对象 遵循知情同意原则,收集河南汉族无亲缘关系的体检健康个体血样 217份,3宗二代家系(父母子)血样共9份。

1.2 TNF基因6个SNPs位点的PCR-RFLP分型取外周静脉血3 mL,EDTA抗凝,常规苯酚-氯仿抽提法提取基因组DNA,用紫外分光光度计测定其含量。-20℃保存。

1.2.1 PCR反应体系及热循环参数 用于扩增TNF基因6个SNPs位点的引物由Invitrogen公司(上海英骏生物技术有限公司)合成,引物序列见表1。PCR反应体系:总体积为25μL,含10×buffer 2.5μL、25mmol/LMg2+1.5μL、2mol/L dNTP 1.0 μL、10mmol/L Primers 2.0μL、Taq DNA聚合酶1 U、基因组DNA(10～100 ng)3.0μL、ddH2O 14.6 μL。PCR反应条件:94℃预变性2 min;94℃变性30 s,55℃退火 45 s,72℃延伸 45 s,36个循环;最后72℃延伸10 min。

1.2.2 PCR扩增产物筛选及酶切产物分型 6个SNPs位点的限制性酶切位点见表1。于PCR扩增产物中加入相应的限制性内切酶进行酶切,酶切反应体系:PCR产物5μL,内切酶2 U,10×酶切缓冲液1μL,纯水补足至总体积 10μL。37℃水浴 16 h。酶切产物用 150 g/L非变性聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳进行检测,250 V 3～4 h。以未酶切的PCR扩增产物作内参。6个SNPs位点各等位基因判断方法见表1。

表1 6个SNPs位点的扩增引物序列、内切酶及等位基因判断方法

1.3 统计学处理 用SHEsis软件[8]进行Hardy-Weinberg遗传平衡χ2检验及单体型分析;等位基因和基因型频率、多态信息含量(polymorphic information content,PIC)、杂合度(heterozygosity,H)、个人识别率(probability of discrim ination power,DP)、非父排除概率(excluding probability of paternity,PE)等用PowerStats V12软件(Promega生物技术有限公司研发)计算[9]。基因多样性(gene diversity,GD)或单体型多样性(haplotype diversity,HD)=[(1-/(n-1)[10];组合基因型类型用Excel表格进行统计分析。

2 结果

2.1 河南汉族TNF基因6个SNPs位点等位基因及基因型频率分布 见表2。河南汉族人群TNF基因6个SNPs位点基因型均分布均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律。

2.2 TNF基因6个SNPs的组合基因型及其单体型估计结果 见表3、4。TNF基因6个SNPs的组合基因型在河南汉族群体 217人中检测出57种类型(表3),H为 0.807。该群体中单体型估计有 25种,PIC为0.857,HD为0.894。

2.3 河南汉族TNF基因6个SNPs位点法医学应用参数及其家系调查结果 见表 5、6。将河南汉族人群6个TNF基因SNPs位点应用于3个家系中,子代基因型符合孟德尔遗传规律。

表2 TNF基因6个SNPs位点的等位基因及基因型频率

表3 TNF-α238/α308/α 850/α857/α863/β252组合基因型估计结果

续表3

表5 河南汉族人群TNF基因6个SNPs位点的法医遗传学参数

表6 TNF基因6个SNPs位点的组合基因型在 3个家系中的分布

3 讨论

法医学个人识别主要是应用短串联重复序列(short tandem repeats,STR)分型技术[11],其遗传标记是核心序列为 2～6个碱基的串联重复,分型技术成熟,应用广泛。随着第三代遗传标记SNP位点的兴起,应用SNP位点分型技术进行法医学个人识别已见报道[12-14]。SNP分型应用于法医学检案的优越性已经越来越明确[12],但仍有必要对大量个体进行基因分型,以找到必要的特异性位点[13]。

作者研究了河南地区汉族人群的6个TNF基因SNPs位点,发现这6个SNPs位点等位基因频率的分布均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律,而且等位基因最小频率均＞5%,说明这6个SNPs位点均具有遗传多态性。利用等位基因频率在 20%～80%的 SNPs标记构建高密度的遗传图谱效果较好[13-14],而这 6个位点中有 2个位点(TNF-β+252和TNF-α-857)的等位基因频率在上述范围内,作为候选SNPs应用于法医学检验更有意义。

对于法医学应用而言,H、GD、PIC、PE和DP等是评价一个或一套遗传标记应用价值大小的主要指标。作者研究的TNF基因上6个SNPs位点单个SNP的各项法医遗传学参数(H、PIC、PE和DP)值相对较低,尚不能达到法医学个人识别和亲子鉴定的要求,但是根据6个SNPs位点构成了57种组合基因型,并推测出25种单体型,PIC为0.857,GD为0.894,说明6个SNPs位点联合应用,其多态性远远大于单一位点。这6个SNPs位点不仅位于同一条染色体上,而且距离不远,符合法医学检验对于SNPs的筛选原则[14]。

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