侧脑室注射链脲佐菌素对大鼠海马tau蛋白过磷酸化表达的影响

陈玉静，田金洲，尹军祥，时 晶，黄小波

(1.首都医科大学宣武医院 中医科，北京 100053；2.北京中医药大学东直门医院，北京 100053)

tau蛋白和Aβ是阿尔茨海默病(AD)的两大病理特征，围绕着二者在AD中的致病机理及治疗对策学术界已开展了一系列研究,以往大多数研究人员把目光集中在以Aβ为目标靶点的药物研发上，但临床研究结果不甚满意，因此，越来越多的研究者已经开始考虑改变AD的药物开发策略。随着以tau蛋白异常磷酸化为靶点的AD发病分子机制研究的不断深入，以tau蛋白为靶标的AD药物研发吸引了越来越多的研究者。近年来有学者[1-2]应用侧脑室注射链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)制备拟AD模型。本研究将在前期研究基础上观察侧脑室注射链脲佐菌素(ICV-STZ)对脑内tau蛋白磷酸化的影响,为该模型的进一步应用和AD的药物研发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及模型制备 SPF级健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠30只,体重250～300 g,购自北京维通利华实验动物中心(合格证号：SCXK京2006-0008)。实验过程中动物自由摄食和饮水(术前禁食除外)，室温22 ℃～26 ℃,湿度28%～30%。30只大鼠随机分成假手术组(对照组)和STZ侧脑室注射组(模型组),每组15只。参考Sharma等[2]研究方法，所有大鼠经10%水合氯醛(3 mL/kg)麻醉后，固定于江湾Ⅰ型C大鼠立体定位仪上,常规消毒皮肤，正中矢状切口，分离骨膜，锥颅器钻开颅骨，暴露硬脑膜。除假手术组外，其余组动物均用微量注射器每侧侧脑室各注射STZ(Merck)约15～18 μL(3 mg/kg,注射前将STZ溶于生理盐水，浓度为25 mg/mL)。坐标参考包新民《大鼠脑立体定向图谱》[3]:前囟后1.5 mm，矢状缝左右旁开1.5 mm，脑表面下3.5 mm。第3天重复注射,剂量同前。假手术组操作同前，以等量生理盐水替代STZ。

1.2 外周血糖检测 分别于术前和术后尾静脉采血,微量血糖仪(Roche)测定外周血糖。

1.3 动物取材 每组各取5只大鼠应用4%中性多聚甲醛经心肌灌注固定，完整取出鼠脑,置后固定液中，脑下沉后即可冰冻切片，行免疫组织化学染色。其余动物在麻醉状态下断头取脑，冰盒上迅速分离海马组织，称重，置于eppendorf管中。经Folin酚比色法对脑组织进行蛋白定量，行SDS-PAGE凝胶电泳。

1.4 免疫组织化学染色及定量分析 免疫组织化学染色采取漂浮染色法,每只大鼠于海马CA1区连续切片,片厚45 μm,采用抗生物素蛋白-生物复合物(ABC)法进行染色，经过1N的HCl修复后，给予3%H2O2消除内源性过氧化物酶的影响，用山羊血清封闭后，加入一抗。一抗为小鼠多克隆抗体tau-1(识别tau蛋白非磷酸化Ser199/202位点)、兔多克隆抗体pS199/202和pS396/404(分别识别tau蛋白磷酸化Ser199/202和396/404位点),4 ℃过夜。加入生物素标记的二抗(稀释度为1∶300)，孵育2 h后,再加入稀释度为1∶300的生物素抗体过氧化物酶标记的链霉卵白素，室温、摇床孵育2 h；DAB显色。每组大鼠各5只，每只鼠脑取3张相同部位的脑切片，共取15张切片计数。采用Kodak图像分析系统及Image-Proplus软件,在10倍物镜下,计算各组海马CA1区域内tau-1、pS199/202和pS396/404的阳性神经元数目。

1.5 免疫印迹分析 各组大鼠在麻醉状态下断头取脑，冰盒上迅速分离海马组织，称重，置于eppendorf管中。经Folin酚比色法对脑组织进行蛋白定量，加入上样缓冲液，煮沸4 min，用10%SDS-PAGE凝胶电泳分离，将蛋白转移到硝酸纤维素膜上，封闭后，用tau-1、pS199/202和pS396/404抗体作用1 h，二抗孵育，显色，扫描仪扫描电泳条带。

2 结果

2.1 外周血糖检测 造模后所有动物常规饲养,死亡率约10%。ICV-STZ模型组和对照组术前和术后(取材前)相比，外周血糖无差异。

2.2 免疫组化结果 见表1。

表1 海马CA1区不同抗体阳性神经细胞数目

2.3 免疫印迹结果 与对照组比较，模型组大鼠海马tau-1条带明显变浅，表明蛋白含量降低；pS199/202和pS396/404条带与对照组比较,明显增粗，表明蛋白含量增多,见图1。

图1 Western blotting检测侧脑室注射STZ对tau磷酸化表达的影响

3 讨论

STZ是一种甲基亚硝基脲产物,对实验动物的胰岛β细胞具有高度选择性的毒性作用，腹腔注射可导致1 型糖尿病,侧脑室注射STZ 后大鼠出现空间学习记忆功能异常,伴海马胆碱乙酰转移酶(ChAT)活性降低[3]。研究发现STZ在脑内干扰胰岛素和胰岛素样生长因子(IGF)信号转导，阻断胰岛素受体自身磷酸化和内在的酪氨酸激酶活性[4]，但未引起外周血糖升高,胰腺结构和胰岛素的免疫活性也未受影响;实验中还发现ICV-STZ模型出现脑体积缩小,细胞丢失、β样淀粉酶(Aβ)沉积增多等一系列衰老的改变，该模型在某种程度上模拟了AD的病理特征[5]，因此有学者应用侧脑室注射STZ来制备痴呆模型[6-7]。

在AD脑中，与神经元丢失相伴随出现的主要有两大病理改变：位于神经元外由β-淀粉样蛋白(β-amyloid,Aβ) 沉积构成的老年斑(senile plaque,SP)以及神经元内由异常过度磷酸化的tau蛋白构成的神经原纤维缠结(neurofibrillary tangle,NFT)[8]。其中NFT是导致神经元纤维退化的主要原因，可作为大脑早老化的标志[9],NFT的主要成分是双股螺旋细丝(Paired helical filament,PHF)，而PHF的亚单位主要是过度磷酸化的tau蛋白。

tau蛋白是含量最高的微管相关蛋白，生理情况下，tau蛋白主要定位于中枢和外周神经系统的神经元轴突内，与微管相结合，促进微管蛋白集聚和维持微管稳定性；并参与维持细胞形态、信号传递和轴突生长发育。tau蛋白的异常磷酸化是AD神经原纤维变性的基础,用特异性抗体和质谱等分析技术证明:在AD脑中tau蛋白至少有21个异常磷酸化位点，异常磷酸化的tau蛋白完全丧失其生物学活性。tau蛋白参与神经原纤维缠结的形成和稳定性的维持，从而在AD神经元退变中起重要作用。因此,研究AD患者tau异常修饰的机制，对最终阻止AD病变具有指导意义。

pS199/202和pS396/404能够识别Ser199/202和Se396/404位点的磷酸化tau蛋白，Tau-1能够识别Ser199/202位点的非磷酸化tau蛋白。本研究中发现ICV-STZ模型大鼠体内Ser199/202和Ser396/404位点磷酸化表达增多，而tau-1的表达减少，这说明在Ser199/202和Ser396/404位点tau蛋白发生了异常磷酸化。由于本研究中选择的位点有限，是否存在其他位点的磷酸化还有待于进一步研究。

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