牛病毒性腹泻病毒基因2型代表株全基因组序列分析

林燕清，朱礼倩，陶 洁，孙宏进，孟祥升，王建业，朱国强

(扬州大学兽医学院，江苏 扬州 225009)

牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)是牛病的主要病原，能引起腹泻、呼吸道症候群、母畜流产、死胎和畸胎、免疫耐受以及先天性缺陷等[1-3]。BVDV分为基因1型(BVDV-1)和基因2型(BVDV-2)。BVDV-1进一步分为11种亚型(BVDV1a-j 10种亚型和鹿群亚型)；BVDV-2分为2个～4个基因群[4-5]。BVDV-2急性感染主要引起出血综合症(HS)，特征为白细胞减少、发热、腹泻、血小板减少、出血和死亡。20世纪80年代，我国李佑民首次分离出BVDV[6]，2003年出现第一株猪源BVDV ZM-95的全基因组序列的报道[7]。

我国对BVDV分离株基因型的鉴定，很少从分子水平上进行，因此本研究将3株BVDV分离株XJ-04、SD-09和QH-09进行全基因组序列测序分析及基因分型，为我国牛病毒性腹泻病(BVD)的分子流行病学研究积累数据，为BVD的预防和控制提供依据。

1 材料和方法

1.1 病毒株、菌株和细胞 BVDV-2型XJ-04株由本实验室分离并鉴定[8,11-12]；(BVDV-2)SD-09株和QH-09株由本实验室分离保存(未发表)；Madin-Darby bovine kidney(MDBK)细胞系由美国宾夕法尼亚大学Dr.Bello惠赠；大肠杆菌DH5α由本实验室保存。

1.2 主要试剂 RNAiso Plus总RNA提取试剂盒和pMD19-T Simple载体均购自TaKaRa公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自TIANGEN公司；DNA连接酶及其试剂盒购自NEB公司。

1.3 病毒RNA的提取 参照文献[8]和[12]的方法经MDBK培养和传代，按RNAiso Plus试剂盒的说明书提取病毒总RNA。

1.4 引物设计 应用DNAStar软件对GenBank中登录的 BVDV-2全基因组序列：890(U18059)、NewYork93(AF502399)、p11Q(AY149215)、C413(AF002227)、1373(AF145967)和 P24515(AY149216)进行比对，在BVDV保守区内，采用PrimerPremier 5.0软件设计引物(表1)，扩增片段分别以A～Q表示，引物由上海基康生物技术有限公司合成。

表1 BVDV-2全基因组扩增的引物Table 1 Primers used for the amplification of isolates genomic fragments

1.5 全基因组序列的RT-PCR检测 常规方法合成内侧片段A～Q的cDNA，并分别以其为模板进行PCR，反应程序为：94℃ 5 min；……