麻鸭白细胞介素17的原核表达及鉴定

赵 雯，潘志明，耿士忠，康喜龙，方 强，丛秋霞，焦新安

(扬州大学江苏省人兽共患病学重点实验室，江苏 扬州 225009)

白细胞介素(Interleukin，IL-17)是一种由效应T细胞产生的细胞因子，可刺激成纤维细胞、内皮细胞、巨噬细胞和上皮细胞产生前炎性细胞因子，包括IL-1、IL-6、TNF-α和趋化因子等，最终诱导炎症反应[1]。2009年Yoo等首先克隆出雌性樱桃谷北京鸭的 IL-17基因(duIL-17)，其序列与鸡 IL-17(chIL-17)和哺乳动物IL-17氨基酸同源性分别为84%和37%[2]，这表明家禽IL-17既具有一定的保守性，又各自具有种属特异性。另外，目前尚未有duIL-17检测试剂的研究报道。为此，本研究克隆我国地方品种麻鸭的IL-17基因，并且进行了原核表达，在此基础上探讨了表达产物的免疫反应性，为duIL-17单克隆抗体的制备提供条件。

1 材料和方法

1.1 实验材料 pGEX-6P-1、DH5α和BL21均由江苏省人兽共患病学重点实验室保存；限制性内切酶BamHⅠ、SalⅠ、高保真TaqDNA聚合酶、pCR2.1载体、T4 DNA连接酶、DNA回收试剂盒和RNA提取试剂盒均购自宝生物工程(大连)有限公司；异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)购自Promega公司；酵母抽提物和蛋白胨购自Oxoid公司；ConA、HRP标记的羊抗鼠IgG购自Sigma公司；小牛血清购自兰州民海生物工程有限公司；麻鸭购自扬州某种鸭场；鼠抗鸡IL-17多克隆抗体(ELISA效价1∶12800)由本实验室制备。

1.2 引物的设计与合成 根据GenBank中登录的17 mRNA序列(EU366165.1)，设计合成一对用于PCR扩增IL-17基因的的引物。上游引物：5'-TAGG ATCCATGTCTCCAACCCTTCGTGCTT-3'；下游引物：5'-TAGTCGACTTGCTCTTGCACCACAGGCTCC-3'。下划线分别为BamHⅠ和SalⅠ限制性酶切位点序列。预期扩增出的目的条带大小为534 bp。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.3 脾脏淋巴细胞的分离 取麻鸭脾脏，将其制成单细胞悬液，分离其中淋巴细胞，将细胞加至24孔培养板中，1×107个/孔，每孔再加入5 μL ConA(500 mg/L)，于5%CO241℃培养。……