HCV NS5A结合蛋白顺乌头酸酶1的验证研究

王晓杰，相久全，韩乐强，张锦前*，成 军

(1首都医科大学附属北京地坛医院，北京100015;2密云县第二医院;3大连市第六人民医院)

HCV与肝脏脂肪变性、糖代谢异常、2型糖尿病等代谢类疾病密切相关［1］，肝脏脂肪变性与慢性丙型肝炎(CHC)疾病进展也有关［2，3］。近年研究发现HCV NS5A可能是肝脏脂肪变性及HCC发生发展的间接机制［4］。2009年9月～2010年9月，我们应用酵母双杂交技术筛选肝脏cDNA文库中HCV NS5A的结合蛋白，并对这些蛋白的相互作用进行实验验证，为HCV影响糖、脂类代谢的分子生物学机制研究提供实验室依据和方向。

1 材料与方法

1.1 材料 肝癌细胞系 HepG2、pGBKT7-HCV NS5A、pcDNA3.1(-)-HCV NS5A、pcDNA3.1(-)-myc-his、pBIND-HCV NS5A、载 体 由 本室 保 存。DMEM细胞培养基购自美国GIBCO公司;酵母双杂交所需各种培养基均购自美国Clontech公司;anti-HCV NS5A及anti-his单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司;细胞转染试剂LipofectamineTM2000、哺乳动物双杂交试剂盒(包括实验所需质粒)、Dual-Luciferase®双萤光素酶报告基因检测系统购自美国Promega公司，逆转录试剂盒购自大连宝生物工程有限公司，引物合成及DNA测序由北京奥科生物公司完成。

1.2 方法

1.2.1 pGBKT7-HCV NS5A转化酵母菌株并进行鉴定 诱饵质粒pGBKT7-HCV NS5A由本所构建保存，将前述质粒用醋酸锂法转导入酵母菌株AH109，随后铺平板(SD/-Trp培养基)，随机挑取直径＞2 mm的菌落PCR鉴定。

1.2.2 酵母菌株Y187(肝细胞cDNA文库质粒转化)与酵母菌株AH109(pGBKT7-HCV NS5A质粒转化)配合 前述鉴定正确的AH109酵母接种于一缺培养基中，30℃振摇至A600为0.8～1.0后重悬于50 ml 2×YPDA培养基中，与4 ml含肝细胞cDNA文库的酵母细胞于摇床中30℃轻微振摇培养配合48 h。显微镜下观察到三叶草二倍体细胞后，离心将其酵母菌重悬于0.25×YPDA培养基，铺三缺及四缺培养板各50块，于孵箱中以30℃培养16 d后，再把直径＞2 mm的菌落于铺有X-α-gal的四缺培养基上划线，生长且呈蓝色的为二者蛋白结合的所筛选阳性的克隆。……