大黄素体外逆转口腔鳞癌耐药细胞株KBV200的机制初步探讨

欧冰凝，唐海桦，张海英，梁 钢*，韦 艳

(1广西医科大学药学院，南宁530021;2广西医科大学公共卫生学院)

多药耐药 (MDR)是肿瘤化疗失败的重要原因，逆转肿瘤MDR是提高其化疗效果的关键。研究发现大黄素(EM)能逆转人乳腺癌细胞MCF-7/Adr、人胆管癌多药耐药细胞QBC939/ADM对阿霉素的抗药性［1～4］，其逆转人口腔鳞癌耐药细胞株的研究还未见有报道。本研究主要探讨EM对人口腔鳞癌耐药细胞株KBV200的体外MDR逆转作用及作用机制，为进一步开展体内逆转作用研究提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 人口腔鳞癌细胞 KB及其耐药株KBV200购自南京凯基生物科技发展有限公司，置37℃、5%CO2、饱和湿度条件下，用含10%新生牛血清的RPMI 1640培养基培养，KBV200细胞培养时加入200 ng/ml VCR维持其耐药性，实验前1～2周停药。0.25%胰蛋白酶消化传代，取对数生长期细胞用于实验。

1.1.2 主要抗体及药物 P-gp鼠抗人单克隆抗体购自SANTA公司，肺耐药相关蛋白(LRP)鼠抗人单克隆抗体购自NeoMarkers公司，TOPO-Ⅱ鼠抗人单克隆抗体、P53鼠抗人单克隆抗体、Bax兔抗人多克隆抗体、Bcl-2鼠抗人单克隆抗体、GST-π鼠抗人单克隆抗体和即用型非生物素免疫组化ElivisionTM plus检测试剂盒均购自福州迈新，DAB显色剂、辣根酶标记羊抗鼠-HRP购自南京凯基生物科技发展有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 EM对KBV200细胞株的逆转作用 选取EM 3个对KBV200抑制率低于10%的药物浓度为实验浓度。取单细胞悬液1×105/ml种板，每孔200 μl，设培养液空白对照孔，阴性对照组(无药作用耐药细胞)，单用VCR组和联合用药组。其中联合用药组分为以下4组，A组:0.7μg/ml EM+长春新碱(VCR);B 组:1.0 μg/ml EM+VCR;C 组:1.4 μg/ml EM+VCR;D 组:5.0μg/ml维拉帕米(VRP)+VCR。其中联合用药组分别加入 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 μg/ml VCR。用 MTT测定各孔的 OD 值，细胞抑制率(IR)=(阴性对照组OD值－药物处理组OD值)/阴性对照组OD值×100%，SPSS13.0软件求IC50。逆转耐药倍数=单用VCR处理KBV200的 IC50/逆转剂联合VCR处理KBV200的IC50。

1.2.2 Western blot检测蛋白P-gp、LRP的表达 2 ml对数生长期的KBV200细胞4×104/ml接种于6孔板，待细胞贴壁后，其中3孔加入终浓度为2.0 μg/ml的VCR，另外3孔加入终浓度为1.0μg/ml的EM和2.0μg/ml的VCR，培养72 h后经裂解、采集、离心后，取上清液进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。P-gp、LRP在7%的分离胶中电泳3 h。将含有蛋白条带的凝胶转膜2 h，后将蛋白条带转移至硝酸纤维素滤膜中，然后将滤膜在5%的脱脂奶中封闭115 h，加入一抗 (P-gp或LRP鼠抗人单克隆抗体)过夜，加入二抗(辣根酶标记羊抗鼠-HRP)2 h，洗膜后ECL荧光定影，然后在暗室中得到胶片。

1.2.3 免疫细胞化学法(ICC)检测 P-gp、LRP、GST-π、TOPO-Ⅱ、P53、Bax 和 Bcl-2 蛋白表达 按试剂盒说明操作，用PBS代替一抗作为阴性对照。取对数生长期KBV200细胞接种于6孔板，待细胞贴壁后，其中3孔加入终浓度为2.0μg/ml的VCR，另外3孔加入终浓度分别为1.0μg/ml和2.0μg/ml的EM和VCR，药物作用72 h后，取出盖玻片，PBS冲洗3次;固定液固定10 min;PBS冲洗3次;加50 μl过氧化酶阻断剂，室温孵育10 min;PBS冲洗3次;加50μl非免疫动物血清，室温孵育10 min;弃去血清，加一抗，4℃过夜;PBS冲洗3次;加50μl生物素标记的二抗，室温孵育10 min;PBS冲洗3次;加50μl链酶素抗生物素—过氧化物酶溶液，室温孵育10min;PBS冲洗3次;加100μl新鲜配制的DAB溶液，显色，显微镜下观察，自来水冲洗;苏木素复染，自来水洗;1%盐酸酒精分化，自来水冲洗;酒精梯度脱水，二甲苯透明，风干;中性树胶封片，PIPS-2020超清晰度病理图文分析系统摄片并检测细胞染色的平均光密度。

1.3 统计学方法 采用SPSS13.0软件进行统计学处理，所得数据以±s表示，以P≤0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 EM对KBV200的逆转作用 课题组前期已研究KBV200对 VCR的耐药倍数为56.70倍［5］。由图1可知，B组KBV细胞的抑制率比单用VCR组大大增强(P ＜0.01)。A、B、C、D 组对KBV200的耐药逆转倍数分别为 1.44、2.87、1.76、1.83 倍，后 3组的逆转作用与单用VCR组比较均有显著性差异(P ＜0.05)，B、D 组间亦有显著性差异(P ＜0.05)。EM对KBV200的逆转作用无剂量依赖关系。

图1 各组药物对KBV200的细胞毒作用

2.2 Western blot法检测结果 见表1。EM联合VCR 处理 KBV200 后，P-gp/β-actin 和 LRP/β-actin分别降至单用VCR组的21%和18%。

表1 EM处理前后KBV200细胞中P-gp、LRP 表达比较(±s，n=9)

表1 EM处理前后KBV200细胞中P-gp、LRP 表达比较(±s，n=9)

注:与单用VCR组比较，*P＜0.01

-actin单用VCR组组别 P-gp/β-actin LRP/β 0.837 ±0.017 0.673 ±0.033 EM 联合 VCR 组 0.176 ±0.009* 0.121 ±0.002*

2.3 ICC检测结果 见表2。

3 讨论

目前认为参与耐药机制主要有多药耐药P-gp、多药耐药相关蛋白 (MRP)、LRP、乳腺癌耐药相关蛋白(BCRP)、抗原加工相关转运蛋白(TAP)。本文研究细胞非毒性剂量下的EM联合抗肿瘤药物VCR对口腔鳞癌耐药细胞株KBV200的逆转作用，发现其有细胞毒增敏作用，但逆转倍数并不是很高(＜6倍)。同时Western blot和ICC两种方法测得的结果都表明EM不同程度地降低P-pg和LRP的表达。研究表明抑制P-gp的表达和功能从而提高细胞内药物浓度是EM逆转MDR的机理之一。故可以认为细胞非毒性剂量下的EM联合VCR可能通过降低P-gp的表达量，增加细胞内VCR的含量而逆转KBV200耐药，LRP表达的改变可能有助于EM在细胞内的分布和化疗药物进入细胞核发挥作用而达到逆转耐药的效果。

表2 EM处理前后KBV200细胞中各蛋白吸光度比较(±s，n=9)

表2 EM处理前后KBV200细胞中各蛋白吸光度比较(±s，n=9)

注:与单用VCR组比较，*P＜0.01

组别 P-gp LRP Bcl-2/Bax GST-π P53 TOPO-Ⅱ单用 VCR 组 1.123 ±0.175 1.095 ±0.021 171.60 ±0.30 1.405 ±0.087 0.007 ±0.001 0.005 ±0.006 EM 联合 VCR 组 0.225 ±0.037* 0.055 ±0.007* 13.80 ±0.20* 1.081 ±0.151 1.033 ±0.166* 0.877 ±0.049*

陈玉英等［6］研究发现大黄素能有效抑制 HL-60/ADR，机制主要通过下调 Bcl-2、c-Myc和Caspase-3前体蛋白表达水平并诱导其凋亡。本文选择3种细胞凋亡蛋白 P53、Bcl-2和Bax来初步探讨EM对KBV200耐药细胞在细胞凋亡方面的调节作用。结果显示，EM上调P53的表达，下调Bcl-2/Bax的比值，促进细胞凋亡。本研究结果为进一步对EM进行体内药效学研究提供实验依据。

［1］姜晓峰，甄永苏.大黄素逆转肿瘤细胞多药抗药性的作用［J］.药学学报，1999，34(3):164-167.

［2］陆长虹，李杰，郭伟剑，等.大黄素对乳腺癌多药耐药细胞株MCF27/Adr的耐药逆转作用［J］.临床肿瘤学杂志，2004，9(4):340-343.

［3］周颉，傅建民，石剑，等.大黄素逆转乳腺癌细胞多药耐药及其对ERCC1蛋白表达的影响［J］.中华肿瘤防治杂志，2010，17(1):27-29.

［4］方志强，张萍，米志坚，等.大黄素对人胆管癌多药耐药细胞QBC939/ADM的耐药逆转作用［J］.中国现代药物应用，2009，3(8):31-33.

［5］张海英，唐海桦，梁钢，等.口腔鳞癌亲本细胞株与耐药细胞株蛋白谱差异［J］.中国公共卫生，2009，25(9):1106-1107.

［6］陈玉英，郑合勇，胡建达，等.大黄素抑制HL-60/ADR耐药细胞增殖和诱导凋亡的作用［J］.中国实验血液杂志，2007，15(5):348-351.