异丙酚舒张离体大鼠肺内动脉的作用及机制*

张光燕，邓春玉，邝素娟，马 珏，崔建修△

(1南方医科大学，广东 广州 510515;广东省医学科学院，广东省人民医院2医学研究中心，3麻醉科，广东 广州 510080)

异丙酚是常用的静脉麻醉药，临床使用时能引起心血管功能抑制效应，导致血压下降。前期已有的研究［1，2］证实异丙酚对血管有直接作用，但具体机制还存在争议。有研究证明异丙酚有舒张血管效应，这种舒张血管效应已在几组体外实验中得到证实，如狗的冠状动脉［3］，大鼠的胸主动脉［4］、肺动脉［5］及人的胎盘血管［6］，而在对狗的肺动脉［7］及大鼠灌注肺的研究［8］中则证明异丙酚可以增加血管的阻力。另一些实验［9，10］表明异丙酚作用于血管主要是通过内皮作用，相反有研究［11］表明其作用是非内皮依赖性的。本实验旨在进一步明确异丙酚的血管效应，本研究采用大鼠二级分支肺内动脉为研究对象，观察异丙酚对外周阻力血管张力的影响以及其作用机制。

材料和方法

1 动物

SPF级健康成年雄性SD大鼠，体重200～300 g，购于中山大学动物实验中心，许可证号为SCXK(粤)2009-0011。

2 试剂与仪器

2.1 主要试剂、药品及溶液 戊巴比妥钠为Merk产品;异丙酚原液(2，6-diisopropylphenol)、血栓素 A2类似物(9，11-dideoxy-11α，9α -epoxymethanoprostaglandin，U46619)、乙酰胆碱(acetylcholine，ACh)、硝苯地平(nifedipine)、EGTA、左旋硝基精氨酸甲酯(Nm-nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride，L-NAME)和DMSO均为Sigma产品，其余试剂为国产分析纯。异丙酚、U46619及硝苯地平溶于DMSO，其余试剂溶于超纯水，对照组已证明最高浓度DMSO(1∶500)对血管张力无影响。Kreb's液(mmol/L:119 NaCl，4.7 KCl，2.5 CaCl2，1 MgCl2·6H2O，25 NaHCO3，1.2 KH2PO4，11.1葡萄糖)。60 mmol高 K+(mmol/L:63.7 NaCl，60 KCl，2.5 CaCl2，1 MgCl2·6H2O，25 NaHCO3，1.2 KH2PO4，11.1 葡萄糖)。无钙的 Kreb's液(mmol/L:119 NaCl，4.7 KCl，500 EGTA ，1 MgCl2·6H2O ，25 NaHCO3，1.2 KH2PO4，11.1葡萄糖)。无钙高 K+(mmol/L:63.7 NaCl，60 KCl，1 MgCl2·6H2O ，25 NaHCO3，1.2 KH2PO4，11.1葡萄糖)。

2.2 仪器 血管张力换能器(DMT)，Stemi DV4体式解剖显微镜(Seizz)。

3 方法

3.1 血管环的制备 150 mg/kg戊巴比妥钠过量麻醉大鼠后放血，迅速取出心肺组织，在预冷的Kreb's液(4℃)中洗净残血，移入盛有预冷Kreb's液并装有硅胶板的培养皿中，用大头钉将心肺组织固定于硅胶板，仔细辨认肺动脉，沿肺动脉主干分离出二级肺内动脉，制备直径为200～300 μm，长度为1～2 mm的动脉环，挂于血管张力器的浴槽中，并持续通入95%O2与5%CO2混和气，温度恒定在37℃。平衡1 h调节血管静息张力至2 mN，并用高钾收缩血管，洗去高钾30 min后再重复1次，对高钾反应良好者说明血管舒缩功能完好，实验中每隔15 min换Kreb's液1次。为避免异丙酚的佐剂对实验的影响，本实验使用异丙酚纯液。

3.2 张力测试

①内皮完整性的测定 未去内皮的血管条用U46619100 nmol/L收缩血管，待张力平衡后加入1 μmol/L ACh舒张，舒张率达到60%以上者认为内皮完整。使用钢丝来回轻柔地摩擦血管内壁几次制备去内皮的血管条，用U46619100 nmol/L收缩血管，以ACh舒张率为零或接近零认为内皮去除完整。

②测定异丙酚的血管舒张效应 不同的内皮完整的血管环分别用高钾溶液60 mmol/L或U46619100 nmol/L收缩血管后，累计加入异丙酚浓度:1、3、10、30、100、300 μmol/L，记录张力的变化。

③测定内皮对异丙酚舒张血管的作用 内皮完整组使用U46619100 nmol/L收缩血管，张力平衡后累积加入异丙酚1、3、10、30、100、300 μmol/L，记录张力的变化，然后用Kreb's液洗脱浴槽中药物，洗4次，待血管恢复静息张力后加入一氧化氮合酶抑制剂L-NAME 1 μmol/L孵育30 mim，使用U46619100 nmol/L 收缩血管，张力平衡后累积加入异丙酚1、3、10、30、100、300 μmol/L，比较孵育前、后的张力变化差异。去内皮组使用U46619100 nmol/L收缩血管，张力平衡后累积加入异丙酚1、3、10、30、100、300 μmol/L，记录张力变化。

④测定Ca2+通道与异丙酚舒张血管的关系 用含EGTA 500 μmol/L的无钙Kreb's将浴槽中的液体置换3次，加入无钙高钾溶液，然后累积加入 CaCl2浓度:0.01、0.03、0.1、0.3、1、3mmol/L记录张力变化，Kreb's液洗脱4次，至血管恢复静息张力，平衡30min，再用含EGTA 500 μmol/L的Kreb's将浴槽中的液体置换3次，加入无钙高钾溶液后，不同的血管分别用异丙酚 10、30、100、300 μmol/L 预孵育 30 min，累积加入CaCl2浓度:0.01、0.03、0.1、0.3、1、3 mmol/L，记录张力变化并与孵育前比较。另一些血管用高钾溶液收缩，张力平衡后加入L-型钙通道阻断剂硝苯地平(nifedipine，1 μmol/L)充分阻断L-型钙通道，加入U46619100 nmol/L再次收缩血管，待张力稳定后累积加入异丙酚 1、3、10、30、100、300 μmol/L，记录张力变化。以高钾或U46619诱发的血管最大收缩幅度为100%，加入药物后血管的收缩或舒张与最大收缩幅度的比值反映血管张力的变化，EC50表示产生50%最大舒张效应时对应的药物浓度，亲和力指数(avidity index)简称pD2，表示引起最大效应的一半时所需的药物摩尔浓度的负对数，pD2=-lg(EC50)。量效曲线应用GraphPad Prism 3.0绘制和分析。

4 统计学处理

结 果

1 异丙酚对预收缩大鼠肺内动脉张力的影响

异丙酚可舒张高钾和U46619引起的肺血管收缩，且产生浓度依赖的舒张效应。高钾组最大舒张效应Emax=(97.57±2.05)%，pD2=4.38±0.08，U46619组最大的舒张效应Emax=(88.18±10.33)%，pD2=4.15 ±0.27，见图1、2。

Figure 1.Propofol induced relaxation in rings precontracted by 60 mmol/L K+-containing solution..n=6.图1 异丙酚对高K+预收缩血管的舒张效应

Figure 2.Propofol induced relaxation in rings precontracted by U46619..n=6.图2 异丙酚对U46619预收缩血管的舒张效应

2 内皮对异丙酚舒张肺动脉的影响

异丙酚能舒张U46619预收缩的内皮完整与去内皮的血管，内皮完整组最大舒张效率Emax=(82.60±22.15)%，pD2=4.21±0.26，L-NAME孵育后最大舒张效率Emax=(77.62±26.58)%，pD2=4.01±0.28，两组比较无显著差异(P＞0.05);去内皮组最大舒张效率 Emax=(86.27±18.37)%，pD2=4.41±0.36，与内皮完整组比较无显著差异(P＞0.05)，见图3。

Figure 3.Propofol-induced relaxation in rings precontracted by U46619 in endothelium-intact，endothelium-denuded and L-NAME treatment groups..n=5.图3 异丙酚分别在内皮完整、L－NAME处理和去内皮组对U46619预收缩血管的舒张效应

3 Ca2+通道与异丙酚舒张血管的关系

3.1 异丙酚对CaCl2诱导血管收缩作用的影响 不同浓度异丙酚(10、30、100、300μmol/L)孵育血管后，CaCl2(0.01-3 mmol/L)刺激血管收缩的剂量-效应曲线明显向右移动，最大收缩幅度Emax降低，呈明显的浓度依赖性，这一结果反映异丙酚可以明显抑制细胞外钙内流，见图4。

3.2 异丙酚对U46619敏感受体操纵性钙通道(receptoroperated calcium channels，ROCC)的作用 高钾收缩血管待张力平衡，加入L型钙通道阻断剂硝苯地平1 μmol/L后，血管张力可降至静息张力水平，说明此浓度的硝苯地平将L-型钙通道完全阻断，再使用U46619收缩血管，异丙酚仍可以舒张U46619预收缩的肺动脉，且最大舒张率Emax=(88.97±5.60)%。这一结果反映异丙酚可能抑制了ROCC相关的钙内流。

Figure 4.CaCl2-induced contraction in Ca2+-free，60 mmol/L K+-containing solution in the absence or presence of propofol(10 to 300 μmol/L)..n=5.*P＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control(propofol 0 μmol/L).图4 不同浓度异丙酚孵育前后，血管在无钙高钾中对CaCl2的收缩反应。

讨 论

本研究探讨了异丙酚对大鼠肺内动脉的张力影响，主要的发现如下:(1)异丙酚可舒张受体依赖及非受体依赖的血管收缩;(2)异丙酚舒张血管不依赖于内皮;(3)异丙酚舒张血管的部分机制可能与抑制VOCC与ROCC相关的钙内流有关。异丙酚可舒张由非受体依赖性的高K+引起的血管收缩和受体依赖的U46619引起的血管收缩，但是舒张的强度不等，300 μmol/L的异丙酚舒张高 K+预收缩的血管大于U46619预收缩的血管。U46619是血栓素类似物，作为血栓素受体A2(thromboxane A2，TXA2)的激动剂收缩血管，TXA2的增高反映了内皮功能的紊乱，异丙酚用于内皮功能紊乱的病人有可能改善血栓素引起的血管收缩。

血管内皮细胞可以合成和分泌许多血管活性物质调节血管平滑肌舒缩。NO是重要的血管舒张因子之一，它由L-精氨酸在一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)作用下合成。NO激活可溶性鸟苷酸环化酶，使平滑肌细胞内cGMP水平升高，从而使细胞内Ca2+减少，引起平滑肌松弛。LNAME可阻断NOS，减少NO的释放，阻断下游途径引起的平滑肌松弛［11］。异丙酚舒张内皮完整的血管，使用L-NAME孵育后，舒张率无显著差异，证明异丙酚舒张血管与eNOSNO-cGMP途径无关。异丙酚舒张去内皮的肺内动脉，且舒张率与内皮完整组无显著差异，说明其引起血管舒张的主要机制依赖于平滑肌层。在一项对离体大鼠胸主动脉的研究［12］中同样观察到异丙酚舒张血管不依赖于内皮，且可能是由于异丙酚阻断了电压门控性钙通道从而阻断了钙内流。另一项对离体大鼠肾动脉的研究［13］中发现，异丙酚能减小高K+、去甲肾上腺素、5-羟色胺及U46619引起的血管收缩，且异丙酚抑制高K+收缩的血管的效能最大，表明其舒张肾动脉的机制可能涉及到抑制细胞外钙内流。本实验与上述实验结果相近。高K+状态下细胞膜去极化，电压门控性钙通道(voltage-operated calcium channels，VOCC)处于开放状态，增加胞外钙离子的浓度可使钙通过电压门控性通道进入胞内引起收缩。使用不同浓度的异丙酚孵育血管，可观察到孵育前后钙离子引起血管收缩有显著差异，且异丙酚抑制钙内流呈浓度依赖性，说明异丙酚可能抑制VOCC相关的钙内流。

血管平滑肌细胞收缩时，胞外钙内流主要通包括VOCC与ROCC［14］。本实验使用硝苯地平充分阻断L型钙通道后，排除L型钙通道影响下异丙酚仍能舒张U46619收缩的血管，这一部分作用可能与TXA2敏感的ROCC相关。ROCC是细胞膜上存在的重要的外Ca2+内流通道，其开放与膜的去极化无关，与受体结合后可使受体依赖的钙通道直接开放，同时可于G蛋白偶联，通过蛋白激酶途径与Rho蛋白激酶(ROCK)信号调节血管平滑肌对Ca2+敏感性。

综上，异丙酚可舒张高钾及U46619预收缩的肺内动脉，且不依赖于内皮，其部分机制可能抑制了VOCC与ROCC相关的钙内流有关。

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