猪RIG-1、TLR-9、IRF-3和IRF-7 mRNATaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

王晓玲，蔺文成，刘芹防，崔尚金*

(1.青岛农业大学动物科技学院，山东青岛266109；2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室，黑龙江哈尔滨150001)

Ⅰ型干扰素(Interferon，IFN-Ⅰ)的模式识别受体包括 Toll样受体(TLR)和 RIG-1样受体(RLR)[1]。病毒侵入机体后，模式识别受体与相应的配体结合后激活通路内的信号传导因子(如干扰素调节因子-3，IRF3；干扰素调节因子-7，IRF7等)，最终激活Ⅰ型干扰素的转录因子。最新研究发现，DNA病毒感染宿主后，宿主的RNA聚合酶Ⅲ能以病毒的基因组DNA为模板合成5'-三磷酸双链RNA，进而由5'-三磷酸双链RNA激活下游的RIG-1信号传导通路，最终诱导宿主合成Ⅰ型干扰素[2-4]。

猪细小病毒(Porcine parvovirus，PPV)能够引发猪繁殖障碍疾病，给养猪业造成了严重的损失。PPV是单链负股的DNA病毒[5]，在病毒感染前期可经由Toll样受体信号传导途径抑制IFN-Ⅰ的分泌[6]，而RNA聚合酶Ⅲ-RIG-1信号传导通路是否在病毒感染后诱发IFN分泌变化中发挥作用尚需实验验证。

本研究构建猪RIG-1、TLR-9、IRF-3、IRF-7和β-actin重组质粒标准品，并建立基于TaqMan探针的荧光定量PCR检测方法，为定量检测IFN-Ⅰ信号传导因子mRNA转录水平、探讨PPV感染后机体的免疫应答、研究DNA病毒拮抗IFN的分子机制提供了有效的技术手段。

1 材料和方法

1.1 病毒株与细胞 107TCID50/mL PPVBQ株[7]第28代细胞毒由本实验室分离保存；猪睾丸(ST)细胞由本实验室保存。

1.2 主要试剂 TRIzol Reagent购自Invitrogen公司；质粒抽提试剂盒、胶回收试剂盒、pMD19-T载体、反转录酶均购自宝生物工程(大连)有限公司；Probe AllinOneTMQ-PCR Mix购自GeneCopoeia公司。

1.3 引物和探针 根据GenBank中RIG-1(EU126659.1)、TLR-9(NM_213958.1)、IRF-3(NM213770.1)和 IRF-7(NM001097428.1)的序列，利用DNAStar、primer 5.0软件分析、设计特异性引物与探针(表1)，管家基因β-actin的引物和探针序列选自文献[8]，引物和探针由哈尔滨赛拓生物技术有限公司合成。……