犬源A型贾第虫real-time PCR检测方法的建立

张 萍，刘远佳，李 结，李金平，孟祥龙，郭建超，李国清

(华南农业大学兽医学院，广东广州510642)

蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia lamblia)是一种多宿主的单细胞真核生物，其滋养体寄生在人或动物的小肠，引起以腹泻为主的贾第虫病[1]。通过分子生物学方法可以将蓝氏贾第虫至少分为7个(A～G)有效集聚体，其中只有A和B型是人兽共患的基因型，可以感染人、犬、猫、家畜和其他野生动物，而其他的集聚体(C-G)则宿主范围较窄[2]。由于贾第虫病的临床症状类似于一般的肠炎、细菌性痢疾、消化不良等，易误诊误治，造成病程由急性转为慢性[3]。因此开展该病原的检测，对其防治有重要意义。

目前，贾第虫的实验室检测方法包括形态学检查、免疫学检测和普通PCR检测等[4]。但这些方法在特异性、敏感性和时效性等方面均存在不足。而实时荧光定量PCR(real-time PCR)技术能够快速、准确、灵敏地对病原DNA进行定量，同时可以动态地研究整个病程中病原数量与疾病进展的关系，从而能够进行疾病的早期诊断、药物疗效观察、病情判断和预后等[5-6]。因此，本实验建立了贾第虫realtime PCR检测方法，为人畜共患的贾第虫的快速诊断和定量检测提供技术手段。

1 材料和方法

1.1 虫株来源 A型贾第虫标准阳性DNA为本实验室分离鉴定并保存[7]；含犬源贾第虫卵囊的粪便采集自广州市某流浪犬收容所；隐孢子虫为上海兽医研究所馈赠，球虫及弓形虫为本实验室保存。

1.2 主要试剂 粪样DNA提取试剂盒及胶回收试剂盒购自OMEGA公司；SYBR GreenⅠ染料、小量质粒回收试剂盒、ExTaqDNA聚合酶、pMD18-T载体试剂盒、PCR试剂均购自宝生物工程(大连)有限公司；……