GB/T 8538－2008 饮用天然矿泉水检验方法 存在的微生物学问题

马群飞 林 坚

福建省疾病预防控制中心

国家质量监督检验检疫总局和国家标准化管理委员会于2008年12月29日公布的GB/T 8538－2008《饮用天然矿泉水检验方法》（以下简称新国标），于2009年4月1日起正式实施。新国标实施一年后，我们根据连续多年监测饮用天然矿泉水水源及其瓶装产品的经验，结合实际应用情况，对新国标中存在的微生物学问题进行探讨，完善、增强标准的可操作性，并为新国标的再次修订提供参考依据。

总则

在新国标4.1.7规定“计算结果除色度、浑浊度以两位有效数字表示外，其他指标均以三位有效数字表示。”不仅对微生物学检验来说，即使是其他的理化检验，这样规定也是不切合实际的。实际上，在新国标中，多处都出现了不符合这个规定的书写方式。新国标4.1.8检验方法的选择规定，“同一个项目如果有两个或两个以上的检验方法时，可根据设备及技术条件选择使用，但第一法为仲裁法。”在新国标4.52大肠菌群检验方法中，第一法多管发酵法是估计概率方法，可信度不高。从检验精度来说，第一法最低检出限为2 MPN/100mL（除标准制定者凭空想象的0 MPN/100mL外），无法满足GB 8537－2008《饮用天然矿泉水》对于大肠菌群定量的要求（主要限量值分别为0、1、2 MPN/100mL），只有第二法滤膜法（直接培养计数法）才可以报告这样的精度。因此，只有第二法才可以作为仲裁方法。在强制性国家标准GB 4789.1－2010《国家食品安全标准 食品微生物学检验 总则》也是明确“食品微生物检验方法标准中对同一检验项目有两个及两个以上定量检验方法时，应以平板计数法为基准方法”。考虑到矿泉水的包装产品属于食品的饮料类别，按照《中华人民共和国食品安全法》的要求，应执行相应的强制性标准。所以，建议在日常工作中，应慎重执行新国标4.1.8的规定，避免导致法律上的纠纷。另外，按照GB 19489－2008《实验室生物安全通用要求》，所有进行致病微生物检验的单位，必须建立二级生物安全实验室，相应检验机构也都应该按照此标准执行。

采集和保存

新国标表4规定，微生物学检验项目的采样容器材质为硼硅玻璃。在4.2.2.2.4要求最好采用具塞广口瓶。在实际工作中我们发现，加热灭菌很容易导致具塞玻璃广口瓶的瓶口破裂，损耗率非常大。建议使用耐高压的聚乙烯或者聚丙烯塑料材质的具塞广口瓶。标准没有对水源的微生物学采样方法进行要求。目前，监督抽样和样品检验工作常常分别由不同的单位完成，如何正确进行无菌采样，更成为不可忽略的问题，标准应对此明确规定。表4规定的微生物学测定项目为“菌落总数、大肠菌群”，与标准后续的检验项目完全不配套，是一个典型的疏忽。采样数量使用“体积/mL”表示，也不符合国家标准的书写规定，建议书写为“体积/（mL）”。表4规定微生物学测定采集500mL水样，也无法满足后续检验方法的要求。因为单单进行一次的四项微生物学指标检验，至少需要600mL（50＋250＋250＋50）水样，更是远远无法满足可能进行的第二次检验的样品需要量。对于样品保藏处理技术，标准规定了6h的冷藏保存时间。但是在GB/T 5750.2－2006《生活饮用水标准检验方法 水样的采集与保存》中，规定0～4 ℃冷藏保存时间为4h，两个相近的标准规定差距明显。另外，表4规定的冷藏温度为2 ℃～5 ℃，而后续的微生物学检验使用的仪器要求使用0 ℃～8 ℃冰箱，冷藏保存的培养基则要求2 ℃～8 ℃保存，对于温度控制的描述显得过于随意。

大肠菌群

新国标沿用了GB/T 8538－1995的多管发酵法和滤膜法，未加修改，所以仍然存在原标准的一些缺陷，如未说明MPN（Most Probable Number，最可能数）的含义、多管发酵全阴性结果时以0 MPN/100mL作为结果直接报告偏差过大、滤膜法未设定平行检验或质量控制要求等。图10最后缺少了一个进行“MPN计数报告”的流程框图。鉴于第一法检验灵敏度无法满足实际工作的要求，操作程序也比较繁琐，可考虑采用定性检验方法，直接在100mL双料乳糖发酵培养基中加入100mL水样，根据是否发酵产气来判断，最为经济省事。另外，在表32应该增加备注，明确当出现005、055这样的结果时，该如何核查实验过程。毕竟这些异常数值的出现，不应该直接作为最终的结果报告。在4.52.2.5.3应明确在培养后“观察滤膜上面的菌落特征。”在4.52.2.5.5之前应明确 “挑取不少于3个（不足3个则全挑）可疑菌落，进行革兰氏染色镜检观察”，否则前后文句不对应。计算公式（115）建议修改为“确证的大肠菌群菌落数（CFU）×100÷过滤的样品量（mL）”。本标准其他的检验项目都附加了质量控制的要求，建议在大肠菌群的检验中，也附加相应的内容。

粪链球菌

新国标4.53.2原理中对于确证实验，漏掉了对于胆汁液态培养基生长的要求。实际上，新国标微生物学检验部分的原理描述完全是步骤的叙述，没有真正描述检验原理。4.53.5.2.3中未明确应该如何挑选可疑菌落进行证实试验。建议描述为“挑取不少于5个（不足5个则全挑）可疑菌落，进行革兰氏染色，粪链球菌应为革兰氏染色阳性球菌，常排列成短链状。根据菌落特征符合情况计数每250mL水样中的典型菌落数”。4.53.5.3.2的过氧化氢酶试验应该描述为“加几滴3%过氧化氢溶液到载玻片的涂抹菌苔上，”因为使用“菌液”来描述“菌苔”不恰当。4.53.5.3.3的胆汁液态培养基使用无菌的100g/L牛胆液，不符合实际工作的需要，建议修改为“100 g/L牛胆盐溶液”。4.53.5.3.4中要求“若菌落能够生长繁殖 ”，因为使用的都是液态培养基，不可能出现菌落，所以建议删除“菌落”两字。4.53.7质量保证（包括其他致病菌项目）使用了大肠埃希氏菌ATCC 25922作为阴性对照菌株，从实验室质量管理的要求来说，应该使用生化特性接近的非特异性菌株。对于粪链球菌Fecal streptococcus的英文名称，不能当作拉丁文学名排成斜体，标准应该直接使用拉丁文学名Enterococcus faecalis这样规范的书写方式。

铜绿假单胞菌

新国标4.54.2原理最后“经证实为铜绿假单胞菌，则其检测结果为阳性”这句话，属于典型的因果关系倒置，建议描述为“检测结果均为阳性者，确证为铜绿假单胞菌。”对于乙酰胺利用试验采用“乙酰胺肉汤”，实际上该培养基不能称为肉汤，建议称为乙酰胺液体培养基或者乙酰胺利用培养基。该试验还要求使用含汞的钠氏试剂，增加了实验室废物排放的负担。对于乙酰胺利用试验，多种产品的检验方法国家标准都有很好的替代手段，可以考虑等效采用。从满足实验需要并保护操作者健康角度考虑，对于紫外灯的功率，应建议限制在8w以下。在图12检验程序里，产荧光（非蓝/绿色）菌落和红褐色菌落的框格下面，建议分别增加一个向下的箭头，否则看不清检验流程。因为4.54.5.4结果观察、4.54.5.5确证性试验和4.54.5.6计数的操作顺序前后交叉，多种专业术语描述混乱，建议合并。“将其他所有红褐色不发荧光的菌落进行氧化酶测试、乙酰胺肉汤、金氏B培养基确证性试验，培养20 h～24 h观察结果，防止因为培养40 h～48 h导致菌落过分生长而出现菌落融合。”这样的描述明显不准确。建议从这里开始修改为“挑取其他所有不发荧光的菌落划线接种营养琼脂平板，36 ℃±1 ℃培养20 h～24 h，进行氧化酶、乙酰胺利用、金氏B培养基产生荧光试验”，之后分别描述各确证性试验的操作方法，最后按照公式（116）进行计算。这样的修改，可以避免漏检那些完全没有色素产生的目标菌。4.54.5.6中“注：最初滤膜上显荧光的菌落经氧化酶反应均呈阳性，因此不需在这个测试中计数（见表35）。”建议整句删除，因为新国标里不存在表35，而这句话也是前言不搭后语。4.54.6“计算菌落数时应考虑到验证试验的比例及特定的水量，如矿泉水、泉水和其他瓶装水 ”，也属于病句，而且本标准不需要考虑除矿泉水之外的其他泉水和其他瓶装水，建议修改为“计算菌落数时应考虑验证试验的结果及过滤的水量”。公式（116）中F应表达为“产生荧光的非蓝绿色菌落数”，如果没有排除蓝绿色菌落，很可能将导致结果偏高。建议在4.54.9质量保证中增加生化特性接近的荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）作为非特异性菌株。

产气荚膜梭菌

新国标4.55.3.1要求配制庖肉培养基，该培养基在标准全文中没有用到，建议删除。4.55.3.6.2和4.55.3.9.1中描述“本培养基应新鲜设备”、“对氨基酸苯磺酸”，明显属于笔误，应该是新鲜制备和对氨基苯磺酸。对于“校正pH＝7.4”之类的描述，因为与其他微生物学检验项目不统一，建议删除所有的“＝”。这个方法的最大疑惑在于其他微生物学检验采用的滤膜孔径都是0.45μm，而产气荚膜梭菌是其中体型最粗大的微生物，却要求使用0.22μm孔径的滤膜，完全没有必要。建议统一使用0.45μm孔径的滤膜，有利于工作的开展。4.55.4.5要求配置的漩涡振荡器全文没有使用到，建议删除。4.55.4.6规定使用常温催化或碱性焦性没食子酸除氧式来满足厌氧培养需要，但是就我们的实际工作经验，这样的简易厌氧培养装置，常常导致目标菌无法形成真正黑色的菌落而漏检。建议尽可能使用厌氧培养箱，如果使用简易厌氧培养装置，对于灰白色菌落也要进行确证性试验，避免漏检。4.55.6质量保证也使用了大肠埃希氏菌作为阴性对照，应该选择生化特性接近的厌氧菌，才能真正满足质量控制的需要。

菌落总数

新国标将菌落总数检验方法归入资料性附录B，但原理说明是经培养后所得1mL水样中所含“菌落”的总数，只包括一群嗜中温的需氧的细菌菌落总数。应该描述为“1mL水样经培养后，一群嗜中温的需氧和兼性厌氧菌形成菌落的数量”。B.4.5.1.1“每次检验时应作一平行接种，同时另用一个平皿只倾注营养琼脂培养基作为空白对照”。按照质量控制的惯例，空白对照肯定需要加入1ml稀释液，而不能仅仅倾注营养琼脂。建议实际操作中同时加入稀释液作为空白。新国标将培养时间从原来的24 h修改为48 h，但是前言没有提及，导致不少基层单位在申报实验室资质认定的标准变更时认为“方法无变化”，而没有进行相应的方法确认工作。B.4.5.1.2又出现了“细菌总数”这个早已淘汰的术语，可能也是标准制定者的疏忽。在B.4.5.2.3要求“以下操作同生活饮用水的检验步骤”，而新国标没有引用GB/T 5750.12－2006《生活饮用水标准检验方法微生物指标》，这样的描述不符合国家标准的书写规范。B.4.7.7要求“菌落数在100以内按实有数报告，大于100时，采用两位有效数字，在两位有效数字后面的数值，以四舍五入方法计算。”这样的规定，不满足实际工作的要求。当平均菌落数在10以下，带有小数点后面的数字时，肯定不能按照实有数报告。因此建议修改为“平均菌落数按照四舍五入方法，修约为整数报告。如修约后的数值超过两位有效数字时，后面的数值用10的指数来表示。”在表B.1的例8报告方式中，要求报告为“＜1×10 CFU/mL”，这也是完全不符合常理的，也影响国家标准的严肃性。