细胞核内特征值的改变可引起DNA倍体的变化

王景洁 孙全新 孙小蓉 牛晓泉

细胞核内特征值的改变可引起DNA倍体的变化

王景洁1孙全新2孙小蓉3牛晓泉4＊

(1武汉市第五医院保健科,武汉430050;2湖北中山医院细胞室,武汉430033;3华中科技大学同济医学院中加肿瘤早期诊断研究中心,武汉 430022;4武汉市第五医院科教科,武汉430050)

目的 通过测定不同DNA倍体细胞,研究细胞核内特征值的改变。方法 用宫颈刷刷出宫颈细胞,经固定后,用涂片离心机制成二张玻片,一张行巴氏染色作 TBS诊断,另一张行Feulgen染色做DNA定量测定。通过对宫颈细胞核图像内像素的统计,计算出细胞核内多种特征值,比较不同DNA倍体细胞内特征值的不同。结果 161873例妇女行宫颈细胞学检查,常规细胞学检查发现2454例低级别鳞状上皮内病变(low-grade squamous intraepithelial lesion,LSIL)和523例高级别鳞状上皮内病变(high-grade squamous intraepithelial lesion,HSIL);而DNA倍体分析发现3412例有3个以上>5c细胞。84%以上的LSIL和 HSIL病例均可见倍体异常细胞。与2c细胞相比,4c、5c、7c及9c细胞核面积及核半径明显增大;7c、9c细胞核内平均光学密度和紧实度均值也有明显改变,而光密度方差和灰度熵无变化。结论 宫颈细胞DNA倍体改变往往伴有细胞形态和DNA核内分布等特征值的改变。

DNA倍体; 图像分析系统; 宫颈癌; 非整倍体细胞

DNA图像分析系统可对细胞核进行定量分析从而测定出细胞核内DNA含量,其主要过程是先将细胞图像进行分割,再计算细胞核的相关特征值,通过对这些特征值的统计和分析,最终将细胞分类及计算细胞核DNA含量。DNA图像分析已经运用于临床检测,尤其是对宫颈细胞进行定量测定[1-3]。宫颈癌是由人类乳头瘤病毒(human papilloma virus,HPV)持续感染宫颈细胞所致。HPV病毒可引起宫颈细胞DNA倍体发生改变[4-6]。因此在大多宫颈癌及癌前病变中,通过DNA图像分析可发现宫颈细胞DNA含量异常,即DNA异倍体细胞[7]。虽然有很多对宫颈细胞进行DNA定量测定的报道,但对其异倍体细胞的特征改变的研究较少。本文试图对宫颈细胞的定量测量,研究异倍体细胞核内特征值改变。

材料和方法

1.标本来源

收集2008-2009年两年内武汉市第五医院和湖北省中山医院进行子宫颈液基薄层细胞学检查的病例161873例,所有病例的年龄均在25-54岁之间。宫颈细胞检查试剂盒由武汉兰丁医学高科技有限公司提供,其中包括:宫颈刷、盛有固定液的标本管、标签等。另有8例宫颈活检证实为宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasm,CIN),其中 3 例CIN2、2例CIN3及3例宫颈癌。这8例来源于湖北省中山医院细胞病理室。

2.取材

妇科医生在阴道扩张器直视下,手持宫颈刷的刷柄,通过扩阴器,将刷头中央较长的刷丝从子宫颈外口插入子宫颈管内,周边刷丝顶部抵触在子宫颈黏膜面,顺时针或逆时针旋转3-5圈,取出宫颈刷后,用镊子夹紧刷头底座,拔脱刷头,将刷尖向下垂直方向浸泡在样本收集管固定液内,旋紧管盖后震荡摇晃,然后将贴上标签的标本管送到细胞实验室制片。

3.液基薄层制片及染色

将装有固定液和刷头的标本收集管,加入消化液放在振荡器上振荡2h,然后将消化后的细胞悬液离心5min(800转/分),弃上清液后,加50%酒精分别清洗、离心2次(800转/分×5min/每次)。然后将用固定液稀释的细胞混悬液,放入细胞涂片离心机甩片5min,每例制成2张薄层细胞学片,其中1片进行巴氏染色做常规细胞学诊断,另外1片进行Feulgen染色做DNA定量测定。

4.常规细胞学诊断

所有巴氏染色片子经两位有经验的细胞病理学医生读片。根据 TBS诊断分为6组:(1)正常或良性;(2)不明意义的非典型鳞状上皮 (atypical squamous cells of undetermined significance,ASCUS);(3)不能除外高级别鳞状上皮内病变的非典型鳞状上皮(atypical squamous cells,cannot exclude highgrade squamous intraepithelial lesion);(4)低级别鳞状上皮内病变(low-grade squamous intraepithelial lesion,LSIL);(5)高级别鳞状上皮内病变(highgrade squamous intraepithelial lesion,HSIL)或原位癌(carcinoma in situ,CIS);(6)不典型腺细胞(atypical glandular cell,A GC)。

5.DNA倍体分析

所有Feulgen染色片用兰丁全自动细胞图像分析系统进行扫描处理,该系统已达到欧洲定量细胞病理学会所制定的有关DNA定量分析图像系统的各项标准[8]。细胞片染色质量控制用大鼠肝细胞片子作对照。一般情况下,该系统对每张玻片上6000个以上的细胞核进行扫描测定。经扫描后的每个细胞核均有77个特征值,其中包括形态特征、吸光特征、具体结构特征、Markovian和非Markovian结构特征和长度特征等。系统根据不同细胞成分所具有的不同特征参数来完成自动细胞分类和计数过程,如正常上皮细胞,增生或癌变细胞,淋巴细胞及未参与诊断的垃圾细胞(重叠细胞核,聚焦不良细胞核和核碎片等)。标准对照细胞为同张玻片上的100个正常上皮细胞,所测出的平均光密度 (integrated optical density,IOD)为2C的参考值,其CV(coefficient of variation)值小于5%。凡是有大于5C以上非整倍体细胞的玻片,都要通过细胞技术员在显微镜下逐一对大于5C细胞进行核实,以排除该系统将垃圾和重叠的细胞核误认为异常细胞。结合TBS诊断与DNA倍体分析结果,如有以下结果,建议作阴道镜检查及活检:(1)LSIL、HSIL、鳞状细胞癌;(2)ASCUS伴有DNA倍体异常者(>5c细胞);③常规细胞学正常,但有2个或3个以上5c细胞。

6.细胞核面积及DNA分布研究

8例病理证实为CIN2或CIN2以上级别的宫颈细胞样本,经DNA倍体分析后均发现有>5c、>7c、>9c的非整倍体细胞。每例宫颈样本测定不同倍体细胞核面积及DNA分布。其8例被测细胞详细情况见表1。

表1 8例不同倍体细胞Table 1 Cell number of different DNA ploid in 8 cases

细胞特征值定义及使用公式如下:

反映细胞核形态的特征值:

细胞核面积是指:核内像素的总和,经换算为平方微米。

平均半径(单位:微米)的计算如下:

细胞的紧实度反映了细胞的圆度,细胞的紧实度值越低表明细胞越圆。其计算方法如下:

compat=p2/(4＊π＊S)

其中,p表示细胞的周长,S表示细胞的面积(平方微米)

反映细胞核内DNA分布的特征值:

平均光学密度的计算方法为:

光学密度方差的计算方法为:

其中,f为积分光学密度,n为细胞在图像中的像素个数。

灰度熵的计算方法为:

其中,i为图像直方图中柱状的个数,Ii为第i个柱状对应的值。

7.统计学方法

对细胞核面积和核内DNA分布的统计,每一例的各级倍体细胞的平均值代表这一例不同级别统计数,例如2c细胞数据是指每例2c细胞的平均值,再将8例的2c细胞数据为一组,与另外倍体细胞组进行比较统计。以2c细胞为标准,用t配对检验,比较其他各不同倍体细胞组,当其他组与2c组比较,P<0.05表示二组间差别为显著性差别。

结 果

1.对161873例病例宫颈细胞进行常规细胞学诊断和DNA定量分析

用常规细胞学诊断 161873例宫颈病例,有153146例诊断为正常和8727例异常,其中5675例为ASCUS,66例为ASC-H,2454例为LSIL,523例为 HSIL,9例为A GC;而DNA定量测定发现有144207例正常、29例增生和17637例有异倍体细胞。在发现有异倍体细胞病例中,有1-2个>5c细胞的病例为14225例,3个以上>5c细胞的病例为3412例。其结果见表 2。从表2可见84.4%的LSIL和96%的 HSIL中可见有异倍体细胞,38.4%的ASCUS中可见有异倍体细胞。在常规细胞诊断为正常病例中有8.39%为异倍体细胞(见表2)。

表2 161873例妇女宫颈样本常规细胞学和DNA倍体分析结果比较Table 2 Results of conventional cytology and DNA ploid analysis in 161873 cervical samples

2.对8例宫颈细胞核特征值测定

通过DNA倍体分析,发现宫颈异倍体细胞随着DNA含量增多,细胞核的形态发生改变,例如:细胞核面积、核半径逐渐增大,与二倍体细胞相比,均有显著性的增大(P﹤0.05),核的紧实度有显著性改变。细胞核内DNA的分布也发生改变,例如:平均OD有显著性改变。灰度熵和光密度方差无显著性差异(表3,表4)。

表中的C表示DNA含量的单位,例如2C表示2倍体,其中,面积的单位为平方微米,半径的单位为微米。将以上数据其它倍体与2倍体进行比较,进行配对t检验,表中上标＊表示与2C比较有统计学显著性差异(P<0.05)。

讨 论

DNA倍体分析用于宫颈细胞学检查已在国内外均有报道[3,7,9],在常规细胞学诊断为LSIL和HSIL病例,大多均含有DNA非整倍体细胞,这与多个作者的结果一致[7,9,10]。而ASCUS病例中也有35%病例也可见DNA非整倍体细胞。在常规细胞学诊断为正常样本中,有8%左右见有>5c非整倍体细胞,ASCUS病例伴有DNA倍体异常或常规细胞学正常而伴有3个>5c以上的非整倍体细胞者多需进一步做阴道镜检查或宫颈病理活检[2,7]。

随着细胞DNA含量改变,细胞核在形态上,DNA含量及核内DNA分布等特征值均发现了改变,即随着DNA含量的增大,细胞核的面积、核半径、积分光学密度等都逐渐增大,光学密度方差、灰度熵没有发生显著性增大或改变,DNA倍体或DNA含量的改变已作为判断细胞癌变的一个很重要的生物特征,通过本文的研究,细胞核面积、半径及平均光密度等也是随细胞DNA含量而变化的,是否可将这些特征值作为判断细胞是否有癌变,还有待进一步研究。

总之,宫颈细胞DNA倍体改变常伴有细胞核内面积、半径及核内DNA分布的改变。

[1]Bollmann R,Méhes G,Speich N,et al.Aberrant,highly hyperdiploid cells in human papillomavirus-positive,abnormal cytologic samples are associated with progressive lesions of the uterine cervix.Cancer,2005,105:96-100

[2]Lorenzato M,Caudroy S,Nou JM,et al.Contribution of DNA ploidy image cytometry to the management of ASC cervical.Cancer,2008,114:263-269

[3]Guillaud M,Benedet J,Cantor S,et al.DNA ploidy compared with human papilloma virus testing(hybrid capture II)and conventional cervical cytology as a primary screening test for cervical high-grade lesions and cancer in 1555 patients with biopsy confirmation.Cancer,2006,107:309-318

[4]Melsheimer P,Vinokurova S,Wentzensen N,et al.DNA aneuploidy and integration of human papillomavirus type 16 e6/e7 oncogenes in intraepithelial neoplasia and invasive squamous cell carcinoma of the cervix uteri.Clin Cancer Res,2004,10:3059-3063

[5]Graflund M,Sorbe B,Sigurdardóttir S,et al.Relation between HPV-DNA and expression of p53,bcl-2,p21WAF-1,MIB-1,HER-2/neu and DNA ploidy in early cervical carcinoma:correlation with clinical outcome.Oncol Rep,2004,12:169-176

[6]Heilman SA,Nordberg JJ,Liu Y,et al.Abrogation of the postmitotic checkpoint contributes to polyploidization in human papillomavirus E7-expressing cells.J Virol,2009,83:2756-2764

[7]Bocking A,Nguyen V.Diagnostic and prognostic use of DNA image cytometry in cervical squamous intraepithelial lesions and invasive carcinoma.Cancer Cytopath,2004,102:41-54

[8]Bocking A,Giroud F,Reith A.Consensus report of the ESACPtask force on standardization of diagnostic DNA image cytometry.Anal Cell Pathol,1995,867-874

[9]Sun XR,Wang J,Garner D,et al.Detection of cervical cancer and high grade neoplastic lesions by a combination of liquid-based sampling preparation and DNA measurement using automated image cytometry.Cell Oncology,2005,27:33-41

[10]Mehes G,Speich N,Bollmann M,et al.Chromosomal aberrations accumulate in polyploid cells of high-grade squamous intraepithelial lesions(HSIL).Pathol Oncol Res,2004,10:142-148

Changes of nuclear features with different DNA ploid

Wang Jingjie1,Sun Quanxin2,Sun Xiaorong3,Niu Xiaoquan4＊
(1Department of Health Care,Wuhan 5th Hospital,Wuhan 430050;2Department of Cytology,Hubei Zhongshan Hospital,Wuhan 430033;3China-Canada Early Cancer Detection Research Center,Tongji Medical College,Huazhong University of Science&Technology,Wuhan 430022;4Department of Education,Wuhan 5th Hospital,Wuhan 430050,China)

Objective To study the nuclear features in different DNA ploids of cervical cells by DNA image cytometry.Methods Cervical cells were collected by a brush and fixed.Two slides per sample were made by a cytospin.One slide was stained by Pap solution for TBS diagnosis,whice the other one was stained by Feulgen for DNA ploidy analysis.Nuclear features,such as nuclear area and mean optical density(OD),were also measured.Results Cervical samples f rom 161,873 women were examined.2454 lowgrade squamous intraepithelial lesions(LSIL)and 523 high-grade squamous intraepithelial lesions(HSIL)were found by TBS diagnosis,while 3 and more than 3>5c aneuploid cells in 3412 cases were determined by a DNA image cytometer.Aneuploid cells werefound in the samplesof 84%LSIL and 96%HSIL cases.Compared to those of 2c cells,the nuclear area,radius,mean OD and compactness were significantly different in 7c and 9c cells,while variance and gray entropy were found the some change.Conclusion Nuclear features of cervical cells are changed with different DNA ploids.

DNA ploid; Image cytometer; Cervical cancer; Aneuploid cell

R361.3

A

10.3870/zgzzhx.2011.04.016

2011-04-10

2011-06-10

王景洁,女(1963年),汉族,副主任医师。

＊通讯作者(To whom correspondence should be addrssed)