Cyclin D1在膀胱癌中的表达及意义

曾文利

(武汉大学人民医院泌尿Ⅱ外科 湖北 430060)

Cyclin D1在膀胱癌中的表达及意义

曾文利

(武汉大学人民医院泌尿Ⅱ外科 湖北 430060)

目的 探讨细胞因子CyclinD1在膀胱癌中的表达及临床意义。方法 收集武汉大学人民医院病理科2000-2006年有完整临床和病理资料的膀胱癌存档蜡块50例和5例癌旁组织,采用免疫组织化学S-P法检测50例膀胱癌和5例癌旁组织中CyclinD1的表达水平,分析了CyclinD1与临床分期,病理分级的关系。采用 HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文报告管理系统,对CyclinD1的表达进行定量分析,并用SPSS13.0软件对各组免疫组织化学反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率做单因素方差分析和SNK(q)检验。结果 CyclinD1在膀胱癌中呈高表达,癌旁组织中呈低表达,差异有显著性 (P<0.05)。图像分析结果显示:膀胱癌与癌旁组织之间,CyclinD1的平均光密度及阳性面积率有显著性差异(P<0.05),经统计学分析,CyclinD1表达与膀胱癌病理分级临床分期无显著性差异(P>0.05)。结论 CyclinD1在膀胱癌中的异常表达可能参与膀胱癌的发生、发展过程。

膀胱癌; CyclinD1; 免疫组织化学

膀胱癌是泌尿系统中最常见的恶性肿瘤,其发生率在男性肿瘤中已上升至第4位,在女性肿瘤中居第8位,其主要的病理类型是膀胱癌,约占90%以上[1]。STA T3是近年来研究异常活跃的转录因子,参与调节细胞周期、增殖和凋亡,又被称为癌基因[2]。CyclinD1是STA T3的一个下游靶基因,其作为细胞周期核因子,可使细胞由 G1期向S期转变促进细胞增殖,是STA T3信号通路中的关键因子。本研究通过检测CyclinD1在膀胱癌的表达,探讨CyclinD1与膀胱癌发生、发展及临床、病理的关系,以提高人们对膀胱癌发生、发展的分子机制及膀胱癌生物学行为的认识。探讨其在膀胱癌发生发展机制中所起的作用。

材料和方法

1.材料

收集武汉大学人民医院病理科2004-2006年病理学证实的膀胱癌病例50例,其中男性38例,女性12例,平均年龄50.3岁,另取5例癌旁组织做对照。标本均经HE染色,光镜观察诊断,按WHO病理分级标准,G1 30例,G2 15例,G3 5例;按UICC临床分期,浅表性肿瘤(Tis-T1)31例,浸润性肿瘤(T2-T4)19例。其中未经化疗的初发肿瘤28例,化疗后复发肿瘤22例。膀胱肿瘤病理分级与临床分期见表1。

2方法

2.1 HE染色 常规取材、固定、脱水、透明、包埋、切片、HE染色及封片

2.2 主要试剂 即用型兔抗人CyclinD1多克隆抗体;(北京中杉生物技术有限公司);超敏即用型SP通用型免疫组织化学试剂盒;(北京中杉生物技术有限公司);DAB显色试盒及多聚赖氨酸 (北京中杉生物技术有限公司)。

表1 膀胱肿瘤病理分级与临床分期Table 1 Bladder tumor Pathological grade and clinical stage

2.3 免疫组织化学SP法检测CyclinD1相关抗原:5μm组织切片常规脱蜡至水后,行柠檬酸缓冲液微波抗原修复,滴加3%过氧化氢抑制内源性过氧化物酶活性,正常羊血清湿盒孵育减少非特异性背景;滴加一抗,4℃孵育过夜;滴加生物素标记的二抗,37℃湿盒孵育10min;DAB显色,光镜下控制反应时间;苏木素复染;分色、返蓝、脱水、透明,中性树胶封片并镜检;用 PBS代替一抗作为阴性对照组,购买的阳性片作为CyclinD1的阳性对照组。

3结果判断

3.1 CyclinD1以细胞浆出现棕黄色颗粒为阳性反应,阴性对照组除细胞核染成蓝色外,应无棕黄色反应产物。

3.2 采用HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文报告管理系统(同济千屏影像公司)对CyclinD1的表达进行定量分析,每张切片随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野(×400),测定每个视野下阳性反应的平均光密度、阳性反应面积和所有细胞总面积,计算阳性面积率。以每例5个视野的平均光密度、阳性面积率的平均值作为该例的测量值。(阳性面积率=单位面积中阳性反应的总面积/单位面积中细胞的总面积×100%)

4统计学处理

采用SPSS13.0软件对各组免疫组织化学反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率作单因素方差分析和q检验,检验水准α为0.05。

结 果

1.CyclinD1的表达

癌旁组织细胞胞浆内可见少量的棕黄色颗粒,CyclinD1表达弱(图1a);膀胱癌细胞胞浆内可见较多棕黄色颗粒,CyclinD1呈强阳性表达(图1b)。图像分析结果显示:膀胱移行细胞癌的平均光密度为0.9851±0.0084;癌旁组织的平均光密度为0.2637±0.0037。膀胱癌的阳性面积率为 1.0658±0.0075;癌旁组织的阳性面积率为 0.2980±0.0046。经q检验,膀胱癌与癌旁组织之间,CyclinD1的平均光密度及阳性面积率有显著性差异(P<0.05)(表 1)。

表1 膀胱癌和癌旁组织Cyclin D1表达的平均光密度和阳性面积率(¯x±s)Table 1 The average optical density and the rate of positive area of Cyclin D1 in transitional cell carcinoma of bladder and cancer side tissue(¯x ±s)

2.CyclinD1在不同分化肿瘤中表达的比较(表2)。

CyclinDI在分化较好的肿瘤中表达高于分化差的肿瘤,统计学分析,P>0.05差异不显著。

表2 CyclinD1在不同分化肿瘤中表达的比较Table 2 CyclinD1 expressed in different tumor differentiation comparison

图1 a.CyclinD1表达弱(SP×200);b.膀胱癌CyclinD1的表达,膀胱癌细胞胞浆内可见较多棕黄色颗粒,CyclinD1呈强阳性表达(SP×200)Fig.1 a.the expression of CyclinD1 in cancer side tissue.There were few brown particles in the cytoplasm,which showed expressed weakly.S-P×200;b.the expression of CyclinD1 in transitional cell carcinoma of bladder.There were plenty of brown particles in the nuclear,which showed CyclinD1 expressed strongly(S-P×200)

讨 论

CyclinD1是 G1/S期过渡检查点的重要调控因子,通过刺激细胞周期素依赖性激酶4(cyclinD-dependent Kinase4,CDK4)介导 Rb基因蛋白产物的磷酸化,从而解除Rb对转录因子E2F的抑制效应,游离的 E2F进入核内结合一系列具有特殊序列的基因启动区,促进这些基因的转录,细胞将通过 G1→S调控点,进入自主分裂程序[3,4]。因此,cyclinD1的表达上调使细胞失控性生长。

cyclinD1是促进细胞周期进行的重要调节因子,许多肿瘤存在它们的表达异常。

细胞在生长因子外源性有丝分裂原的刺激下,CyclinD1mRNA和蛋白表达明显增加,到 Gl期中部达高峰,Cyclin E在CyclinD1高峰后开始表达增加,于 G,/S转折点处达峰值。CyclinD1、Cyclin E分别与CDK4、6和CD凡结合形成复合物发挥作用。CyclinD1过度表达,使细胞周期 Gl/s转换时间缩短,进而促进细胞周期的进程和细胞过度增殖,导致细胞癌变。本实验发现CyclinD1作为原癌基因,促增殖作用的细胞周期素,在分化较好增殖较少的高分化肿瘤中表达更多。以往研究表明,表达野生型PRb的正常细胞和肿瘤细胞和G1进展都需要有CyclinD1,而 PRb失活的细胞株中CyclinD1蛋白和mRNA水平都很低下,其功能也不为细胞周期进展所需要。也许正是由于Rb的表达缺少造成了高分级膀胱癌中CyclinD1的低表达率。高分级膀胱癌中活跃的细胞增殖可能还存在除CyclinD1之外的调控机制。CyclinD1过表达在膀胱癌组与癌旁组织比较差异显著,与临床分期无关。由此推测,CyclinD1过表达可能是膀胱癌发生过程的早期事件,CyclinD1可能是在以细胞增殖为必要步骤的始发阶段发挥作用,不参与肿瘤的浸润、转移过程。

多项研究表明,cyclinD1为stat3信号转导通路的下游靶基因。Amin等[5]在淋巴瘤细胞中选择性抑制stat3活性可明显促进细胞凋亡、导致细胞周期G1期的延长。Leslie等[6]研究证明stat3是通过其SH2结构域与v-Src结合,上调cyclinD1 mRNA和蛋白的表达,加快细胞增殖,介导细胞恶性转化。STA T3作为一种关键性的细胞内信号转导蛋白,主要通过酪氨酸磷酸化作用成为磷酸化STA T3单体,并形成二聚体转移入核,调控下游靶基因的转录,在前列腺癌、乳腺癌、头颈部癌等恶性肿瘤组织和细胞株中存在异常表达和活性增强,提示STA T3在癌肿发生和发展中起重要作用[7,8]。本研究的结果也表明,CyclinD1在膀胱癌中呈高表达,癌旁组织中呈低表达,差异有显著性 (P<0.05)。这些结果提示:cyclinD1在膀胱癌中异常高表达可能促进了肿瘤细胞周期循环加速和细胞持续异常增殖,推测cyclinD1在膀胱癌的发生和发展中起了一定的作用。

肿瘤的治疗中,一个非常重要的问题是如何判断肿瘤的生物学特性。目前还没有合适的生物学指标可以准确的预测膀胱癌的发展和预后。cyclinD1在膀胱癌的发生发展中起了重要作用,有可能成为判断膀胱癌生物学行为的重要指标。

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urothelial carcinoma of the urinary bladder report of seven new cases.European urology,2006,50:1111-1114

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[5]Amin HM,McDonne TJ,Ma Y,et al.Selective inhibition of STAT3 induces apoptosis and G(1)cell cycle arrest in AL K-positive anaplastic large cell lymphoma.Oncogene,2004,23(32):5426-5434

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Expression of Cyclin D1 in bladder carcinoma and its signif icance

Zeng Wenli
(Department of Urology,Renmin Hospital of Wuhan university,Hubei 430060,china)

Objective To investigate the expression of CyclinD1 in bladder carcinoma and its clinical significance.Methods The paraffin blocks of 50 cases of bladder transitional cell carcinoma and 5 cases of adjacent tissues with a complete clinical and pathological data were collected f rom the department of pathology in Renmin Hospital of Wuhan University between 2000 and 2006.Immunohistochemical SP method was performed to detect CyclinD1 expression in the blocks.The relationship between CyclinD1 expression and clinical stage and pathological grade was analysed.HPIAS-1000 high resolution color graphic pathology report management system was used to analyze the quantitative analysis of CyclinD1.The single factor analysis of variance and SN K(q)test were applied to analyze the average optical density of positive particles and the positive area rate of immunohistochemical reaction of each group.Results CyclinD1 was highly expressed in bladder carcinoma but weakly expressed in adjacent tissues,and the difference was significant.Image analysis showed that the average optical density and the positive area rate of CyclinD1 was significantly different between bladder cancer and adjacent tissue(P<0.05).Statistical analysis showed that the expression of CyclinD1 had no significant difference between high and low differentiated groups(P>0.05).Conclusion Abnormal expression of CyclinD1 in bladder carcinoma may be involved in tumorigenesis and development.

Transitional cell carcinoma of bladder; CyclinD1; Immunohistochemistry

R735.2

A

10.3870/zgzzhx.2011.04.013

2011-03-10

2010-06-11

曾文利,女(1970年),汉族,硕士。

＊通讯作者(To whom correspondence should be addressed)