饮食限制58 d对小鼠学习记忆及抗氧化能力的影响＊

邵邻相， 李 姣， 徐玲玲， 张均平，来树圆， 蔡舒君， 叶信哲

(浙江师范大学化学与生命科学学院，浙江金华 321004)

饥饿是指食物供应受到限制以至于断绝，或食物摄入受到影响，使机体处于能量和营养素摄入不足或缺乏的状态．大量研究表明，饥饿可延长多种动物的寿命［1］，延缓或减少退行性疾病包括癌症、糖尿病和神经障碍等的发生［2］，改变动物的能量代谢、免疫功能［3］、激素分泌［4］．由于自然的、社会经济的和病理的原因造成饥饿和营养不足依然是当今世界面临的一个现实问题．动物为了生存，就需要改变生理机能和调整代谢过程，通过利用自身贮存的能量物质提供能量．因此，对饥饿的研究日益成为人们关注的话题．另外，在神经系统的损伤机制中，自由基起着重要的作用，有研究发现［5］，过多的自由基能引起神经细胞膜和细胞器结构改变和功能障碍．在神经退行性疾病发生过程中，离子平衡紊乱和兴奋性神经毒性导致的过量自由基能促进细胞死亡［6］，这说明脑的功能(包括学习记忆功能)与抗氧化功能存在一定的关系．本文以ICR小鼠为研究对象，通过检测不同程度饮食限制(Dietary restriction，DR)下小鼠的行为及抗氧化能力的变化，探讨了限食小鼠学习记忆与抗氧化能力的关系．

1 材料与方法

1．1 试剂与仪器

硫代巴比妥酸(TBA)，三氯乙酸(TCA)，邻苯三酚，乙二胺四乙酸二钠(EDTANa2·2H2O)．均为分析纯，购自金华医药公司．

水迷宫行为分析系统(TSE System GmbH，德国);高速冷冻离心机(Sigma公司);紫外分光光度计(Biochrom英国)．

1．2 动物分组与处理

健康ICR小鼠30只，清洁级，周龄12～13，由金华市实验动物中心提供．小鼠适应1周后进行预实验．预实验中设置40%，60%和80%限食度，实验结果发现40%和60%限食度之间没有区分效应，而80%限食度导致小鼠大量死亡．因此，选取40%限食度和60%～80%限食度之间1/3的限食水平，即66．7%限食度．实验结果证明40%和66．7%限食水平下能表现出一定的区分效应．预实验结束后，选取30只雄性小鼠随机分为自由饮食组、40%DR组和66．7%DR组．每天定时限量喂食，自第1天开始每天按20%限量喂食逐级递减，达到预设饮食限制度后，维持该饮食限制水平喂食58 d．饮食限制39 d后，陆续采用Y迷宫、开场行为、水迷宫分别检测小鼠的学习记忆、自发活动及空间识别能力．饮食限制58 d时处死小鼠，测定小鼠各器官的脏器系数、超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量．

1．3 开场行为观测

开场行为检测小鼠自发活动［7］．观察并记录小鼠在3 min内出现的以下指标:跑动格数(同时记录1 min内的跑动格数)、大便粒数、理毛次数、理毛延时、理毛潜伏、扶壁次数、扶壁延迟、扶壁潜伏，以及站立延时、站立潜伏、站立次数．

1．4 学习记忆功能检测

Y迷宫检测小鼠学习记忆能力［7］．以小鼠电击后直接逃至安全区为正确反应，进入电击区或返回起步区为错误反应．每只小鼠重复训练50次．学习训练24 h后检测记忆力，每只小鼠检测20次．

水迷宫检测小鼠空间识别能力［7］．训练3 d，第4天进行定位航行测试，记录小鼠在控制区的游动距离、访问次数、经历时间、潜伏期，以及在平台上的逗留时间．

1．5 脏器系数测定

小鼠称质量后处死，取甲状腺、脾脏、肝脏、脑组织、睾丸和心脏，吸去脏器表面的血液及体液后称质量并记录．

1．6 SOD活性和MDA含量测定

邻苯三酚自氧化法［8］测定SOD活性．MDATBA比色法［8］测定MDA含量．

1．7 统计学分析

用SPSS12．0软件进行结果的方差分析，实验数据以均数±标准差(x±s)表示．

2 结果

2．1 饮食限制对小鼠体质量的影响

从图1可以看出:自由饮食组小鼠的体质量变化不大，40%DR组和66．7%DR组小鼠的体质量都在限食13 d左右开始下降，到37 d左右有所恢复，但都比自由饮食组小鼠的体质量轻，且66．7%DR组小鼠的体质量降幅最大．

2．2 饮食限制对小鼠自发活动的影响

由表1可以看出:与自由饮食组相比，40%DR组小鼠的各项行为指标与自由饮食组的都相差不大，不具有统计学意义;而66．7%DR组小鼠在1 min和3 min内的跑动格数、3 min扶壁次数和扶壁延时与自由饮食组小鼠和40%DR组小鼠相比都显著增加．实验各组小鼠在3 min内的大便粒数、扶壁潜伏、理毛次数、理毛延时、理毛潜伏、站立次数、站立延时和站立潜伏均无明显的变化．

图1 饮食限制对小鼠体质量的影响

表1 饮食限制对小鼠开场行为的影响(x±s)

2．3 饮食限制对小鼠学习记忆及空间识别能力的影响

表2显示:各组学习成绩中，40%DR组小鼠显著高于自由饮食组和66．7%DR组．与自由饮食组相比，66．7%DR组小鼠的记忆成绩最低，而潜伏期最短．另外，自由饮食组小鼠的游动距离最长，而逗留时间最短．各组小鼠的访问次数无明显区别．

表2 饮食限制对小鼠学习记忆及空间识别能力的影响(x±s)

2．4 饮食限制对小鼠脏器系数的影响

表3显示:与自由饮食组比较，40%DR组和66．7%DR组小鼠各器官的脏器系数都有所增加．40%DR组小鼠的心脏、肝脏和脾脏的脏器系数相比自由饮食组和66．7%DR组最高，其中与自由饮食组相比，40%DR组小鼠的肝脏、脑和脾脏的脏器系数具有统计学意义(P ＜0．05)．66．7%DR 组小鼠的脑、甲状腺和睾丸的脏器系数在实验各组中最高，其中脑的脏器系数与自由饮食组相比差异具有统计学意义(P ＜0．05)．

表3 饮食限制对小鼠脏器系数的影响(x±s)

2．5 饮食限制对小鼠组织SOD活性的影响

表4显示:与自由饮食组比较，40%DR组和66．7%DR组小鼠的心、肝、脾、脑、肾和睾丸组织的SOD活性没有统计学意义，但40%DR组和66．7%DR组小鼠的心、肝和脑的SOD活性相比自由饮食组有所下降，其中66．7%DR组小鼠脾脏的SOD活性相比自由饮食组最高．

2．6 饮食限制对小鼠组织MDA含量的影响

表5显示:与自由饮食组比较，66．7%DR组小鼠的心、肾和脑中MDA含量最高，40%DR组小鼠的肝脏MDA含量相比自由饮食组和66．7%DR组为最高，而脾脏中MDA含量相比自由饮食组和66．7%DR组为最低．

表4 饮食限制对小鼠组织中SOD活性的影响(x±s)

表5 饮食限制对小鼠组织中MDA含量的影响(x±s)

3 讨论

许多小型哺乳动物的体质量受食物质量或者食物资源的影响［9］．若限食幅度较小，则动物可以通过提高消化道的吸收率增加能量摄入，通过调整代谢率和活动行为调节能量支出，从而维持能量平衡和体质量稳重．然而，随限食程度的增加，动物不能通过能量摄入和支出的调节来弥补限食或饥饿导致的食物缺乏，从而表现为体质量降低［10］．有研究［11］显示，动物体质量的变化也受限食程度的影响．在本实验中，限食小鼠体质量先减少后慢慢恢复，但不能恢复到正常水平，且限食组小鼠体质量的减幅与限食程度成正比．

开场行为中，动物爬格子数反映其兴奋性，站立贴壁次数反映其在新异环境中的自发活动能力，理毛次数、理毛延时、理毛潜伏反映其对新环境的满意程度，大小便次数、扶壁次数、扶壁延时、扶壁潜伏反映其紧张程度．在本实验中限食小鼠在新异环境中表现得很不安，而对探究行为和对新异环境的满意程度没有影响，由此我们可以认为它们之间不存在必然的联系．Y迷宫显示40%限食使小鼠学习能力显著升高，这与邵邻相等［12］对饥饿胁迫小鼠的研究结果一致，但其记忆能力随饮食限制程度的升高而减弱，这反应出饮食限制对大脑思维和反应产生了一定的制约作用．水迷宫显示随着限食程度的加深，空间识别的潜伏时间逐渐缩短，表明在一定范围内小鼠对控制区的空间识别能力随着限食程度的增加而加强．

饥饿可使动物产生全身性的器官衰竭，神经内分泌功能发生紊乱［13］．脏器系数是衡量动物健康的重要指标，依据脏器系数可大体确定动物内脏器官病变的性质和程度［14］．本实验中40%DR组和66．7%DR组小鼠各器官的脏器系数相比自由饮食组都有所上升，且40%DR组小鼠的脾脏系数、肝脏系数显著增大，说明40%饮食限制对小鼠脾脏和肝脏产生了一定程度的损伤，也提示饥饿对机体器官的损伤并不一定与饥饿程度成正比．

本实验显示饮食限制对小鼠各组织中SOD活性没有影响，但脑、肾和心中MDA含量随饮食限制水平升高而增大，说明饮食限制使小鼠抗氧化能力有所下降，这与都丽萍等［15］对大鼠限制热量的研究结果相一致．

从学习记忆与抗氧化能力的关系来看，本实验中限食小鼠脑中的SOD活性下降、MDA含量增加，说明限食小鼠脑中脂质过氧化物产生增多，脑的抗氧化能力下降，但其学习能力及对空间的识别能力有所增加，而记忆能力有所减弱．这与石俊等［16］研究指出:动物处于饥饿状态一段时间以后可发生海马细胞核DNA损伤及细胞死亡，从而造成学习记忆能力损害的结果不一致．这可能是饥饿程度与其所研究的饥饿水平不一样所致．

综上所述，饮食限制可引起机体一系列生理生化变化，在抗氧化能力及记忆能力上影响不显著，但适度的限食能够较显著地提高小鼠的学习能力．当然，饮食限制过度能对小鼠产生毒害作用，最终因耗竭或并发症而死亡［17］．因此，何种程度的限食才是最适量的，有待进一步研究．

［1］Mattson M P．Neuroprotective signaling and the aging brain:take away my food and let me run［J］．Brain Reg，2000，886(12):47-53．

［2］Patel N V，Finch C E．The glu cocorti coif paradox of caloric restriction in slowing brain aging［J］．Neurobio Aging，2000，23(5):707-717．

［3］徐世侠，叶广俊，薛彬，等．早期限食对仔鼠胸腺凋亡的影响［J］．营养学报，2000，22(1):55-58．

［4］邓利，张为民，林浩然．饥饿对黑鱼血清生长激素、甲状腺激素以及白肌和肝脏脂肪、蛋白质含量的影响［J］．动物学研究，2003，4(2):94-98．

［5］Johnson V J，Kim S H，Sharma R P．Aluminum-Maltolate Induces Apoptosis and Necrosis in Neuro-2a Cells:Potential Role for p53 Signaling［J］．Toxicol Sci，2005，83(2):329-339．

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［7］邵邻相．大豆磷脂对小鼠学习记忆及脑内SOD和脂褐素含量的影响［J］．浙江师范大学学报:自然科学版，2003，26(3):275-277．

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［10］Zhang Li'na，Wang Dehua．Effects of food restriction and refeeding on energy balance regulation in Mongolian gerbils［J］．BFDG Abstracts/Appetite，2008，51(4):751-764．

［11］赵志军，曹静，王桂英，等．随机饥饿和重喂食对小鼠能量代谢和行为的影响［J］．兽类学报，2009，29(3):277-285．

［12］邵邻相，徐丽珊，丁淑静．饥饿胁迫对小鼠学习记忆、SOD和心肌丙二醛的影响［J］．动物学杂志，2002，37(6):21-24．

［13］练有文，王晖．小鼠脏器重量、脏器系数的测定［J］．中国比较医学杂志，2006，16(5):285-287．

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［17］梁虹，张知彬．食物限制对鼠类生理状况的影响［J］．兽类学报，2003，23(2):175-182．