固相微萃取与气相色谱-质谱联用法对不同酒龄黄酒的微量风味分析与应用

江伟，兰玉倩，2，黄毅，薛洁，张五九

1(中国食品发酵工业研究院，北京，100027) 2(云南农业大学食品科学技术学院，云南昆明，650201)3(国家地质实验测试中心，北京，100037)

固相微萃取与气相色谱-质谱联用法对不同酒龄黄酒的微量风味分析与应用

江伟1，兰玉倩1，2，黄毅3，薛洁1，张五九1

1(中国食品发酵工业研究院，北京，100027) 2(云南农业大学食品科学技术学院，云南昆明，650201)3(国家地质实验测试中心，北京，100037)

通 过固相微萃取-气相色谱-质谱联用法检测了黄酒中34种风味成分，即醇类8种、酯类14种、醛类4种、酸类5种、酚类1种、内酯类1种和杂环类1种，该法精密度为4.42% ～13.44%，回收率为78.44% ～118.92%，检出限为0.002～13.92 μg/L，该法准确可靠、操作简便。利用该法检测了不同酒龄的黄酒，发现黄酒中所测的风味化合物含量总和为726.233～1 290.769 mg/L－1，醇类、酯类和醛类是黄酒的主体香气，分别占风味化合物含量总和的63.68% ～71.10%、27.84% ～34.09%、＜2%。黄酒中主要化合物依次为β-苯乙醇、乳酸乙酯、异戊醇、异丁醇、乙酸乙酯、丁二酸二乙酯和2，3-丁二醇等。醇类在陈酿期间呈下降趋势，表明醇类主要是酿造过程产生，这是醇不断被氧化成酸所致;酯类是酒体变得醇香浓郁的重要原因，在陈酿期间呈先下降而后上升的趋势，这可能是陈酿后期醇酸酯化反应或酯交换的原因;醛类呈上升趋势，主要是陈酿过程中经高级醇的氧化或美拉德反应而来，其中5-甲基糠醛、糠醛和苯甲醛增加比例在10～40倍之间，是黄酒老化的重要指示剂。

发 酵酒，SPME，GC-MS，风味成分，酿造，老化

作为我国特有的发酵酒，黄酒在古今中外都享有很高的声誉，被誉为“液体蛋糕”。但黄酒的质量控制常以常规理化指标和感官品评为主。黄酒中除了水、乙醇和糖类、氨基酸、蛋白质、色素等不挥发成分外，还存在微量且复杂的风味成分，它们至关重要。这些微量风味成分的含量及差异不仅是影响感官品评的直接因素，且也是区分不同酒龄黄酒的关键。

由于黄酒存在不挥发成分，因此黄酒的前处理方法成为分析其微量风味成分的关键。从1980年起，王荣民等人便借鉴其他食品、饮料的顶空进样法分析了黄酒［1］。20世纪90年代开始，黄酒的研究工作逐渐增加，如张笑麟等人采用液液萃取的方法(乙醚做溶剂)分析了黄酒酒脚中的乙酸乙酯［2］，1999年鲍忠定等人采用液液萃取定性了40多种香气成分，并通过直接进样定量了异戊醇、乳酸乙酯、β-苯乙醇［3］;2000年以后许多学者陆续通过静态顶空［4］、动态顶空［5－6］和固相微萃取［7－8］等前处理方法，结合气相色谱仪或气相色谱质谱联用仪测定了黄酒中的风味化合物进行了定量或半定量的分析。

为研究不同酒龄黄酒中风味物质的变化，本文结合前人的检测方法，采用毛细管色谱柱，结合顶空固相微萃取与气相色谱-质谱联用法，分析检测了包括醇、酯、酸、酚和内酯类在内的34种微量风味物质，并分析了不同酒龄的黄酒中微量风味成分的主要变化因子，为黄酒的质量控制提供科学依据。

1 材料与试剂

1.1 原料

不同酒龄的黄酒原酒由企业提供，同一原酒酒龄分别为 1、4、6、8 和12 年。

1.2 实验器材

Clarus 600型气相色谱-质谱联用仪，配有EI离子源(PerkinElmer，美国);万分之一天平(Shimadzu，日本);固相微萃取装置配 SPME手柄(Supelco，美国);Xutemp恒温水浴锅(杭州雪中炭恒温技术有限公司，中国);85 μmPA 萃取头(Supelco，美国)。

1.3 试剂

NaCl(分析纯);内标试剂(2种):乙酸正戊酯(≥98.5%，Fluka公司)，2-壬醇(≥97%，Fluka公司)。

标准试剂(34种):乙酸乙酯(≥99%，Acros公司)，丙酸乙酯(≥99%，Fluka公司)，丁酸乙酯(99%，Acros公司)，乙酸正丁酯(99%，Sigma-Aldrich公司)，异丁醇(99%，Fluka公司)，乙酸异戊酯(≥99%，Acros公司)，戊酸乙酯(99%，Acros公司)，2-甲基-1-丁醇(异戊醇)(≥99%，Sigma-Aldrich公司)，异戊醇(98%，Acros公司)，己酸乙酯(99%，Acros公司)，2-庚醇(≥99%，Acros公司)，庚酸乙酯(99%，Sigma-Aldrich公司)，乳酸乙酯(＞97%，TCI公司)，正己醇(≥98%，Fluka公司)，辛酸乙酯(≥99%，Acros公司)，糠醛(≥98%，Fluka 公司)，2-乙酰呋喃(98%，J＆K 公司)，苯甲醛(≥98%，Acros公司)，2，3-丁二醇(98%，Acros公司)，5-甲基糠醛(≥97%，Fluka公司)，丁酸(≥99%，Acros公司)，苯乙醛(≥99.5%，Acros公司)，糠醇(99%，Acros公司)，异戊酸(99%，Acros公司)，丁二酸二乙酯(99%，Acros公司)，苯乙酸乙酯(≥99%，Fluka公司)，乙酸苯乙酯(≥99%，Fluka公司)，己酸(98%，Acros公司)，β-苯乙醇(99%，Fluka公司)，庚酸(≥99%，Fluka公司)，苯酚(≥99%，Acros公司)，γ-壬内酯( ＞98.0%，TCI公司)，辛酸(≥99.5%，Acros公司)，棕榈酸乙酯(≥95%，Fluka公司)。

标准储备液的配制:移取适量的各个标准试剂至100 mL容量瓶中，配制成标准储备液，低温避光处保存。

内标储备液的配制:移取乙酸正戊酯和2-壬醇各100 μL至100 mL容量瓶，用无水乙醇定容，分别配制成877 mg/L和823 mg/L标准储备液。移取标准储备液1 mL至25 mL容量瓶中，用无水乙醇定容，配制成35.08 mg/L和32.92 mg/L标准工作液，低温避光处保存待用。

2 实验条件

2.1 色谱条件

毛细管色谱柱:WAXETR 30 m×0.25 mm×0.50 μm(PerkinElmer，美国)。

柱温程序:起始温度35℃，恒温2 min，以4℃/min升温至80℃，以2℃/min程序升温至140℃，以5℃/min程序升温至230℃。

载气(高纯氦气):纯度≥99.999%，流速1 mL/min，不分流进样;进样口温度:220℃。

2.2 质谱条件

离子源温度:250℃，传输线温度:250℃，电子轰击源:70 eV;扫描范围:30～550 amu，定性采用全扫描模式(SCAN)，见图1。定量采用选择离子扫描模式(SIM)。采集方式为SIM时，整个分析过程分为32个通道(包括内标化合物乙酸正戊酯和2-壬醇)。36种化合物(含内标)的SIM采集参数及定量特征碎片离子见表1。由表1可知，通过NIST谱库的检索，所有组分均在80.6%以上，定性结果可靠。

图1 标准溶液总离子流扫描图

2.3 黄酒的前处理

首先将被测黄酒的酒精度稀释至体积分数为6%v/v。

移取稀释后的酒样6 mL于20mL的顶空瓶中，加入3 g NaCl，加入30 μL的内标工作液，放入磁力搅拌转，密封。在550 r/min转速下搅拌一段时间后，插入85 μmPA萃取头，纤维头置于距离酒样表面约20 mm的上部空间，在一定的水浴温度下萃取一段时间后，取出手柄，直接进样分析，并解析一段时间。

3 结果与讨论

3.1 SPME萃取条件的优化

3.1.1 搅拌时间的选择

本研究实验了搅拌时间在10、15、20、25和30 min这5段时间对萃取效果的影响。搅拌后在40℃水浴温度下萃取40 min，取出手柄，直接进样分析，解析5 min。结果表明，当搅拌时间达到15 min时，溶液已平衡。

3.1.2 萃取温度的选择

在搅拌样品15 min后，分别在 20、30、40、50和60℃水浴温度下萃取40 min，取出手柄，直接进样分析，解析 5 min。结果发现，随着水浴温度的增加，目标化合物的响应值不断增加，但当超过一定温度后，目标化合物的响应值逐渐减小。研究表明，当水浴温度在50℃下，绝大部分目标化合物的响应值最高。

3.1.3 萃取时间的选择

在搅拌样品15 min后，在50℃水浴温度下分别萃取20 min、30 min、40 min、50 min，取出手柄，直接进样分析，解析5 min。结果表明，萃取40 min时，萃取效果达到最佳。

3.1.4 解析时间的选择

表1 HS-SPME与GC-MS联用法的定性和定量方法的主要参数

在搅拌样品15 min后，在50℃水浴温度下萃取40 min，分别解析3 min、4 min和5 min。发现解析时间在3 min和4 min时，异戊醇、丁二酸二乙酯、乙酸苯乙酯、β-苯乙醇、γ-壬内酯、辛酸和庚酸有不同程度的残留。因此，本实验的最佳解析时间为5 min。

因此，黄酒前处理的条件确定为:样品密封后，在550 r/min转速下搅拌15 min后，插入85μmPA萃取头，纤维头置于距离酒样表面约20 mm的上部空间，在50℃的水浴温度下萃取40 min后，取出手柄，直接进样分析，并解析5 min。

3.2 定量

3.2.1 标准曲线的建立

考虑到黄酒基质的影响，本研究采用标准加入法，即在稀释后的6 mL黄酒中加入不同体积的标准储备液后(见表1)，根据前处理方法实验，结果见表1。该法相关系数为0.9929～0.9998，表明该方法定量可靠。

3.2.2 方法的精密度

为确保实验的重复性和稳定性，本文按照3.3对同一黄酒连续前处理了6次，测定结果见表1。结果显示，所有化合物的精密度均在4.42%～13.44%之间，可见该方法在测定黄酒时能达到稳定检测的目的。

3.2.3 方法的检出限和回收率

为衡量本法对化合物的灵敏度，将低浓度标准使用溶液进行测定分析，用于计算噪音。通常定义检出限为噪音的3倍(S/N=3)。检出限的结果见表1，其范围在0.002～13.92 μg/L，满足微量风味成分的检测。

在样品中加入少量高浓度的标准储备液，按3.3操作，重复测定4次，回收率结果为见78.44% ～118.92%(表1)，回收情况良好，测定结果可靠。

3.3 结果与讨论

我们采用新建立的SPME-GC-MS法分析了不同酒龄黄酒中的34种香气成分，具体检测含量见表2。

黄酒含量最多的风味依次为β-苯乙醇、乳酸乙酯、异戊醇、异丁醇、乙酸乙酯、丁二酸二乙酯和2，3-丁二醇等。醇类化合物是黄酒中的主要风味成分之一，本研究共检测了8种主要醇类化合物，见图2。陈酿1年、陈酿4年、陈酿6年、陈酿8年和陈酿12年的黄酒中总醇含量分别为848.434 mg/L、592.301 mg/L、542.878 mg/L、471.507 mg/L 和 740.430 mg/L，分别占风味化合物含量总和的65.73%、66.69%、71.10%、64.93%和63.68%。β-苯乙醇、异戊醇和异丁醇是黄酒中含量最高的3种醇，含量分别为201.848～413.271 mg/L，185.964～288.923 mg/L和64.868～162.120 mg/L－1，分别占醇类含量总和的42.81%～55.81%、33.79%～40.30%和9.13%～19.11%。由数据可知，尽管醇类化合物在陈酿过程中含量有所波动，但总体上醇类化合物的含量随陈酿时间的增加而呈下降趋势，且醇类中β-苯乙醇、异戊醇和异丁醇对黄酒的风味起着重要贡献。这些醇类主要是原料中的蛋白质、氨基酸和糖类在发酵过程中降解而成，原料中蛋白质分解生成氨基酸受酵母的作用发生脱氨、脱羧，从而降解生成各种醇，成为黄酒中芳香呈味成分之一［3，6］。例如亮氨酸降解产生异戊醇，缬氨酸降解产生异丁醇，苯丙氨酸降解产生β-苯乙醇［3，6］。这些醇类含量随陈酿时间不断下降主要是醇类物质被不断氧化成酸所致［6］。

酯类化合物是黄酒中种类最多的一类物质，本研究共检测了14种酯，见图2。陈酿1年、陈酿4年、陈酿6年、陈酿8年和陈酿12年的黄酒中酯类含量总和分别为439.086 mg/L、289.871 mg/L、212.534 mg/L、245.801 mg/L和396.379 mg/L，分别占风味化合物含量总和的34.02%、32.64%、27.84%、33.85%和34.09%。其中最主要的酯类有3种，依次为乳酸乙酯、乙酸乙酯和丁二酸二乙酯，含量分别为186.027～386.736 mg/L、17.818～48.160 mg/L和5.838～12.320 mg/L，分别占酯类含量总和的84.29%～88.08%、8.38%～12.15%和2.38%～3.66%。数据显示，随着陈酿时间的延长，黄酒中酯含量呈现先下降后上升的趋势，这与前人研究的酯类化合物随陈酿时间延长不断增加存在着差异［6］。在陈酿初期酯类主要来自酵母生物合成而来，但由于黄酒体系不稳定性导致酯类化合物不断水解，但随着陈酿时间的延长，在陈酿过程中发生了化学变化即醇与酸进行的酯化反应或酯交换，从而促使酯类含量不断增加［6］。醇的酯化反应主要为乙酯类，酸的酯化反应主要为乳酸酯，这也是酒体变得醇香浓郁的重要原因［6］。除此之外，丙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、苯乙酸乙酯、乙酸苯乙酯的含量相对较小，大部分在0.010～ 0.335 mg/L。

黄酒中还存在醛类物质，本研究主要检测了4种醛类。醛类属羰基化合物，是成品酒风味老化的相关重要物质，醛类主要由高级醇的氧化或美拉德反应而来，有研究已经证明某些醛类是啤酒老化风味的重要指标［9］。尽管醛类含量占风味化合物含量的比例不到2%，远低于醇类和酯类所占比例，但醛类也是构成黄酒风味的重要成分之一。主要的醛类化合物含量由高到低依次为糠醛、苯甲醛、苯乙醛，含量分别为1.658～17.409mg/L、0.171～2.441mg/L和0.118～0.220 mg/L，分别占醛类含量总和的80.75%～94.65%、3.36%～16.26%和1.09%～9.88%，见图3。通过数据可知，醛类随着陈酿时间的延长不断增加，表明黄酒中的醛类物质主要是在陈酿过程中产生，此变化与前人研究的情况相近［5］。但值得关注的一点是，本研究中糠醛的含量随陈酿时间也是在不断增加，这与郑春亮等人、罗涛等人研究的结果相近［8，10］。此外，5-甲基糠醛从初始的 0.003 mg/L上升到了0.113 mg/L，几乎增加了40倍，增加显著的物质还有糠醛和苯甲醛，增加率也达到了10倍，因此结果表明醛类物质，尤其是5-甲基糠醛、糠醛和苯甲醛是黄酒老化的重要指示剂。

酸类也是构成黄酒风味的成分之一，本研究测定了5种酸(不包括乳酸)，见图4。酸类含量占风味化合物含量总和的比例不到1%，它们虽陈酿时间的增加而增加，但与乳酸相比(黄酒的含量约在3 000 mg/L左右，约占总酸含量的50.95% ～58.29%)，这几种酸对香气的贡献较小。

此外黄酒中还存在酚类、内酯类和杂环类，检测了苯酚、γ-壬内酯和2-乙酰呋喃的含量，但其含量均＜0.1 mg/L，占风味化合物含量总和的比例均 ＜0.01%，但由于其低风味阈值，对黄酒陈酿香味的形成具有不可忽视的作用。

表2 实际黄酒样品的检测结果(含量单位:mg/L)

4 结论

本文通过固相微萃取-气相色谱-质谱联用法同时检测了黄酒中34种风味成分。通过该法检测了不同酒龄的知名黄酒中34种微量风味成分的含量，总和为726.233～1290.769 mg/L，含量最多的风味依次为β-苯乙醇、乳酸乙酯、异戊醇、异丁醇、乙酸乙酯、丁二酸二乙酯和2，3-丁二醇等。按类别来分，醇类、酯类和醛类是主体香气，分别占风味化合物含量总和的63.68% ～71.10%、27.84% ～34.09%、＜2%。醇类含量呈下降趋势，表明醇类主要是酿造过程产生，在陈酿过程中不断被氧化成酸;酯类是酒体变得醇香浓郁的重要原因，在陈酿期间呈先下降后上升的趋势，这可能是因为在储存初期黄酒体系不稳定性导致酯类化合物不断水解，而此后黄酒中醇与酸又进行着酯化反应或酯交换促使酯类含量增加;醛类呈上升趋势，主要是陈酿过程中经高级醇的氧化或美拉德反应而来，其中5-甲基糠醛、糠醛和苯甲醛增加比例在10～40倍之间，是黄酒老化的重要指示剂。

图2 不同陈酿时期的黄酒中主要酯类和醇类的含量

图3 不同酒龄黄酒中醛类风味化合物的含量

图4 不同陈酿时期的黄酒中主要酸类的含量

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Analysis and Application of Trace Compounds in Rice Wine by Solid-Phase Micro Etraction and Gas Chromatograph-Mass Spectrum

Jiang Wei1，Lan Yu-qian1，2，Huang Yi3，Xue Jie1，Zhang Wu-jiu1
1(China National Research Institute of Food and Fermentation Industries，Beijing 100027，China)2(Yunnan Agricultural University，Kunming 650201;3 National Research Center for Geoanalysis，Beijing 100037，China)

34 flavor compounds，including 8 alcohols，14 esters，4 aldehydes，5 acids，1 phenol，1 lactone，and 1 heterocycle，were determined in rice wine by solid-phase micro extraction and gas chromatograph-mass spectrometer.The precisions of the method ranged from 4.42%to 13.44%.The recoveries were 78.44%～118.92%with the detection limits in the range of 0.002 ～ 13.92 μg/L.All data above-mentioned demonstrated it was a good method.Rice wine with different ages determined by this method.The total content of flavor compounds ranged from 726.233 mg/L to 1290.769 mg/L.The main compounds in rice wine were alcohols，esters and aldehydes，accounting for 63.68% ～71.10%，27.84% ～34.09%，lower than 2%，respectively.Compounds with high content in rice wine in order were β-phenylethanol，ethyl lactate，iso-pentyl alcohol，isobutanol，ethyl acetate，diethyl succinate，2，3-butanediol and so on.The alcohols during aging decreased due to the oxidation，while the esters during the later aging increased because of the esterification and transesterification reaction.In addition，aldehydes during aging also increased by oxidation and maillard reaction.5-methyl-2-furaldehyde，furfural and benzaldehyde increased by 10～ 40 times during aging demonstrated those three compounds could be used as aging indicators of rice wine.

brewed wine，SPME，GC-MS，flavor compounds，brewing，aging

博士。

2010－11－02，改回日期:2010－12－15