Galectin-1在大肠癌细胞系中的表达及意义

吕志强，朱曦龄，郭晓东，马立芝

(武警总医院急救医学中心，北京100039)

·基础研究·

Galectin-1在大肠癌细胞系中的表达及意义

吕志强，朱曦龄，郭晓东，马立芝

(武警总医院急救医学中心，北京100039)

目的 探讨Galectin-1在大肠癌细胞系中的表达情况，以及与大肠癌侵袭、转移的关系。方法用Real time-RT PCR法和免疫组织化学法分析Galectin-1mRNA及蛋白在5种大肠癌细胞系的表达情况;用Boyden小室法比较5种大肠癌细胞系的侵袭转移能力。结果 Galectin-1在大肠癌转移灶来源的细胞系中的表达高于大肠癌原发灶来源的细胞系(P＜0.01);Boyden小室的结果显示大肠癌转移灶来源的细胞系的侵袭，转移能力高于大肠癌原发灶来源的细胞系。结论 Galectin-1的高表达可能与大肠癌的侵袭转移有一定关系。

结直肠肿瘤;凝集素类;肿瘤转移;肿瘤侵润

大肠癌为消化道常见恶性肿瘤。近年来，大肠癌在我国发病率及死亡率均呈上升趋势。其中肿瘤早期转移是死亡的关键原因，所以研究与大肠癌侵袭、转移的相关因素，探索新的抗肿瘤途径对于临床治疗具有重要的意义。

Galectins属于凝集素家族，是人体内大量存在的一大类糖结合蛋白。它参与细胞的增殖、分化、凋亡及免疫调节等多种生物功能［1］。Galectin-1是该家族中第一个被发现的成员，研究表明，它与肿瘤的转移、浸润、生长和粘附有关［2］，目前已进入临床试验研究［3］。在本研究中，我们观察Galectin-1在不同转移能力的大肠癌细胞系的表达，分析其在肿瘤发生、转移中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞 人大肠癌细胞株 LoVo、SW620、SW480、HT29、LS174T购自中国医学科学院肿瘤研究所。SW620与LoVo来源于大肠癌患者的淋巴结转移灶，具有较高的侵袭转移能力;SW480，HT29和LS174T都来源于大肠癌的原发病灶，侵袭转移能力相对较低。

1.2 主要试剂 RPMI1640培养基(Gibco公司)，TRIzol购自Invitrogen公司，SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒购自TaKaRa公司，Reverse Transcription System试剂盒购自Promega公司，侵袭小室(Boyden小室)购自Chemicon公司，鼠抗人Galectin-1单克隆抗体、免疫组织化学染色试剂盒SP-9000购自武汉博士德公司。

1.3 细胞培养 细胞株 LoVo、SW620、SW480、HT29、LS174T至于37℃、5%CO2培养箱内培养，培养基采用含10%胎牛血清的RPMI1640。

1.4 Real-time PCR检测细胞系中Galectin-1 mRNA的表达

1.4.1 RNA的制备 待细胞生长状态良好、铺满瓶壁后，提取细胞总RNA，参照TRIzol试剂说明书。

1.4.2 cDNA第1链的合成 按照逆转录试剂盒说明书进行逆转录反应，反应总体系为20 μl。42℃反应1 h，95℃灭活逆转录酶5 min。

1.4.3 荧光定量PCR(Real-time RT－PCR) 基因β-actin作为内参，同时检测Galectin-1和β-actin的表达，计算出样本中Galectin-1mRNA的相对表达量，以Folds=2－ΔΔCt表示实验组与对照组目的基因表达的倍比关系［4］，ΔΔCt=［Ct(target gene)－Ct (β-actin)］实验组－［Ct(target gene)－Ct(β－actin)］对照组。重复3次，计算平均值。在本实验中实验组为SW620，LoVo，HT29、LS174T;对照组为SW480。采用Primer 5.0设计引物。应用Mx3000P定量 PCR仪(Stratagene)进行实验，反应条件为94℃ 30 s，55℃30 s，72℃30 s，45个循环，荧光信号检测。

1.5 免疫组织化学方法检测Galectin-1在大肠癌细胞系中的表达 免疫组织化学方法按照说明书常规操作。以鼠抗人Galectin-1单克隆抗体(1∶200)为一抗，以羊抗鼠为二抗(即用型抗体)，用苏木素进行复染细胞核。出现棕黄色为阳性，按照颜色深浅，分为弱阳性(+)、阳性(++)与强阳性(++ +)。

1.6 细胞体外侵袭实验 应用Boyden小室法［5］，该小室是利用Engelbreth Holm-Swarm(EHS)小鼠肿瘤组织成分重新构建的人工基底膜ECMatrixTM，小室孔径为8.0 μm。

实验前将Boyden小室从冰箱中取出，置于培养箱中，使之温度调节到37℃。在内室中加300 μl无血清的RPMI-1640培养液，置于培养箱中孵育1～2 h，使ECMatrix层亲水。细胞用胰酶消化制成单细胞悬液，无血清的RPMI1640洗3遍后，细胞计数，上室接种肿瘤细胞300 μl(含1×105个细胞);用500 μl含10%胎牛血清的完全培养基作为趋化因子置于下室。37℃、5%CO2湿化培养箱内孵育48 h，取出小室，用棉签擦去上室内未穿过滤膜的细胞，取出滤膜，中性甲醛固定，苏木素染色。在200倍光镜下随机取5个视野计数，取其均值代表浸润力量值。

1.7 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件包进行处理，Real-time RT－PCR的结果采用析因设计的方差分析，体外侵袭实验的结果采用完全随机设计的方差分析，两两之间的比较采用LSD法。

2 结果

2.1 Galectin-1 mRNA在细胞中的表达 细胞总mRNA经逆转录成cDNA后，进行荧光定量PCR检测，在溶解曲线上未见到杂峰，说明没有非特异性扩增，扩增产物单一。从扩增曲线可见所有样品均已进入平台期，说明反应条件准确。产物通过琼脂糖电泳鉴定，5个不同的样品扩增得到的产物单一，符合引物设计时的扩增长度(195bp)。通过对各样本Ct值进行计算分析，以SW480为对照组，其余各细胞系为实验组，结果发现 SW620，LoVo，LS174T，HT29中 Galectin-1 mRNA的表达水平分别是SW480的13.7，6.8，1.21，0.47倍，差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.2 Galectin-1的免疫组织化学检测结果 Galectin-1在SW620中表达呈强阳性，在SW480中表达呈弱阳性。

2.3 5种细胞系体外侵袭实验 48 h后可以看到肿瘤细胞降解滤膜上的人工基底膜胶，并穿过微孔，结果显示各细胞系的浸润能力为SW620(132.6± 13.4)，LoVo(118.9±17.2)高于SW480(96.2±10.3)，LS174T(70.2±5.9)，HT29(52.1±7.8)(P＜0.05)。

3 讨论

Galectin-1属于凝集素家族，国内外许多研究已经证实，其在黑色素瘤［6］、胰腺癌［7］、前列腺癌、甲状腺肿瘤、结肠癌、膀胱癌及卵巢癌等多种肿瘤中的表达增高，并与其发生及转移相关［8-9］。近年来，研究证实了Galectin-1能通过调节肌动蛋白细胞骨架，促进肿瘤血管生成，促进肿瘤细胞的侵袭、迁移［10-11］。

在本研究中，SW480，HT29和LS174T都来源于大肠癌的原发病灶，SW620和LoVo来源于大肠癌患者的淋巴结转移灶，通过荧光定量PCR检测，发现Galectin-1 mRNA在大肠癌转移灶来源的细胞系(SW620，LoVo)中的表达高于原发灶来源的细胞系(SW480，HT29，LS174T)。通过免疫组织化学，发现Galectin-1蛋白在转移灶来源的大肠癌细胞系SW620中表达为强阳性，而在原发病灶来源的细胞中表达呈弱阳性。某一特定的肿瘤组织中，并不是所有的细胞都具有相同的转移能力，只有一部分细胞具有较高的转移能力，可以形成转移灶。也就是说来源于转移灶的肿瘤细胞，可能具有某些使其运动能力增强，促进其转移的物质。通过Boyden小室实验，我们证实了来源于转移灶细胞系的侵袭转移能力在体外高于原发灶来源的细胞系。由此，认为Galectin-1的高表达与细胞的侵袭转移能力有一定的相关性。

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The expression of Galectin-1in human colorectal carcinoma cells and its significance

LV Zhi-qiang，ZHU Xi-ling，GUO Xiao-dong，MA Li-zhi(Emergency Center，General Hospital of Armed Police Forces，Beijing 100039，China) Corresponding author:GUO Xiao-dong，E-mail:Guoxiaodong59122@sina.com

Objective To explore the expression of Galectin-1 gene in colorectal cancer cell lines and its correlation with tumor metastasis.Methods Expression of Galectin-1 in colorectal cancer cell lines was detected by Real time－RT PCR and imunohistochemistry.In vitro invasiveness was determined by Boyden chamber assay.The correlation of Galectin-1 expression with the invasive ability was also analyzed.Results Galectin-1 was highly ex-pressed in LoVo and SW620.In vitro，cell invasivion demonstrated that LoVo and SW620 had a higher invasive ability than LS174T，SW480 or HT29.Conclusion Galectin-1 may play an important role in invasion and metastasis of colorectal cancer.

Colorectal neoplasms;Agglutinins;Neoplasm metastasis;Neoplasm invasiveness

R735.34

A

10.3969/J.issn.1672-6790.2012.04.022

2012-01-09)

吕志强，主治医师，E-mail:wjjzklzq@163.com

郭晓东，副主任医师，E-mail:Guoxiaodong59122@sina.com