鸦胆子油HPLC-ELSD指纹图谱研究

郭 辉， 胡 晨， 钱俊青， 李 宏， 岳昌林

(1.浙江九旭药业有限公司，浙江金华321016;2.浙江工业大学药学院，浙江杭州310014)

鸦胆子又名老鸦胆 Brucea javanica(L．)Merr．，苦参子。性寒，味苦，有小毒，归大肠和肝经。中医以其清热解毒、截疟、止痢，腐蚀赘疣等功效，一般用于热性赤痢、便血、疟疾、鸡眼及疣等治疗，为《中华人民共和国药典》收载品种［1-3］。鸦胆子中含有20%左右的脂肪油类成分，即鸦胆子油。七十年代以来许多研究表明鸦胆子油是一种疗效确切的新型广谱抗肿瘤药，目前已广泛应用于临床，用于消化道肿瘤、肺癌及宫颈癌等的治疗［4-6］。鸦胆子油的主要成分是甘油三酸酯，相关文献采用GC分析鸦胆子油中甘油三酯的脂肪酸成分，表明鸦胆子中的脂肪酸主要是油酸、亚油酸、亚麻酸、软脂酸和硬脂酸［7］，活性成分主要是油酸和亚油酸。目前，在鸦胆子油的质量控制中一般采用GC方法分析控制脂肪酸成分［8-9］，这套分析评价方法中，对鸦胆子油中原有甘油三酸酯类成分先进行水解，然后再进一步甲酯化确定成分，过程检测的是鸦胆子油水解产物脂肪酸，同时由于气相操作温度过高，原有一些不饱和脂肪酸类成分容易氧化。另一方面由于甘油三酯在紫外区基本无吸收，当前采用HPLC方法分析鸦胆子油一般是采用柱前衍生化的方法，将其水解成脂肪酸再对其进行酯化使其产生紫外吸收进行分析［10-11］，该衍生化过程操作繁琐。而蒸发光散射检测器对无紫外吸收的成分能够提供较好的检测结果，国内外一些相关的研究表明蒸发光检测器对于油脂类成分分析检测有较好的响应结果［12-13］。本实验建立 HPLCELSD特征指纹图谱方法，为有效控制和科学评价鸦胆子油的质量提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器与试剂 Agilent 1200型高效液相色谱仪(美国Agilent公司，配chemstation色谱工作站，包括四元高压梯度泵、自动进样器、柱温箱);Alltech 3300型蒸发光散射检测器;Agilent 6210 LC/TOF液质联用仪;Sartorius电子分析天平 (北京赛多利斯仪器系统有限公司);HWS24型电热恒温水浴锅 (上海一恒科技有限公司);R—201型旋转蒸发器 (上海申生科技有限公司);正己烷、异丙醇 (色谱级，天津博迪化工有限公司);乙腈、甲醇 (色谱级，默克公司)。

1.2 试药 鸦胆子 (浙江九旭药业有限公司提供)批号及来源见表1;三油酸甘油酯对照品 (中国药品生物制品检定所，批号111692-200501)。

表1 鸦胆子油批号及来源Tab.1 Batches and sources of Brucea javanica oil

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱;流动相为66%乙腈，20%异丙醇，14%正己烷;体积流量1.0 mL/min;蒸发光检测器，检测温度70℃;载气流量1.5 mL/min;进样量 2 μL。

2.2 对照溶液的制备 取三油酸甘油酯对照品适量，精密称定，用甲醇配制成质量浓度为3.019 mg/mL的对照品溶液，冷藏备用。

2.3 供试品溶液的制备 取鸦胆子粗粉约3 g，精密称定，加入石油醚 (60～90℃)30 mL，超声处理 (功率280 W，频率42 Hz)30 min，滤过，滤液置50 mL量瓶中，用石油醚 (60～90℃)30 mL，分次洗涤滤器和滤渣，旋转蒸发脱去溶剂，获得鸦胆子油。取0.1 g鸦胆子油溶于异丙醇中，并定容至10 mL。0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验 取20100101批次药材，制备成供试品溶液，按2.1项下方法连续进样6次，测得其各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3.0%，表明精密度良好。

2.4.2 重复性试验 取20100101批次药材，制备成供试品溶液6份，按2.3项下操作制备供试品溶液，按2.1项下方法分别进样，测得其各共有峰相对保留时间、相对峰面积的RSD均小于3.0%，表明重复性良好。

2.4.3 稳定性试验 取20100101批次药材，制备成供试品溶液，按2.1项下方法分别在0、2、4、6、8、12、24 h进样测定，其各共有峰相对保留时间、相对峰面积的RSD均小于3.0%，表明样品溶液在24 h内稳定。

2.5 样品测定 取10批鸦胆子样品，按2.3项下方法制备供试品溶液，在2.1项下的色谱条件下依次进样检测，记录色谱图，共获得9个共有峰。典型鸦胆子油色谱图见图1。

图1 鸦胆子油色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of Brucea javanica oil

2.6 特征指纹图谱的建立

2.6.1 参比峰的选择 在各批次样品图谱中三油酸甘油酯的色谱峰 (6号峰)峰位居中，峰面积较大且为所有样品共有，所以确定三油酸甘油酯为参照峰。以其保留时间和峰面积为1.0，计算各批指纹峰的相对保留时间和相对峰面积。

2.6.2 特征指纹图谱的建立及相似度评价 将所得的10批鸦胆子油HPLC图谱以AIA格式依次导入《中药色谱指纹图谱相似度评价》软件 (2004年A版)，以S1批药材谱图作为参照谱进行指纹匹配，建立了共有模式见图2。相似度分析见表2。

图2 10批鸦胆子油HPLC特征指纹图谱Fig.2 HPLC chromatograms of 10 batches of Brucea javanica oil

表2 鸦胆子油指纹图谱相似性分析Tab.2 Results of 10 batches of Brucea javanica oil sample similarity

2.7 HPLC-MS分析 采用HPLC-MS联用技术对鸦胆子的化学成分进行了结构推测。结构鉴定依据是:APCI质谱中甘油三酸酯裂解成甘油二酸酯，裂解出来的甘油二酸酯相对丰度会存在一定差异，一般在APCI质谱中存在分子离子峰以及一些裂解单脂肪酸的甘油二酸酯峰，而这些甘油二酸酯［M+H·RiCOOH］+的相对丰度可以说明脂肪酸是否处于sn-2位置，甘油三酸酯在sn-2位置裂解出脂肪的离子碎片 ［M+H·R2COOH］+，需要更大能量，可能性较小［14-16］。由此结合分子量和相对丰度，指认出油酸亚麻酸亚油酸甘油酯 (1号峰)、1，2-二亚油酸-3-油酸甘油酯 (2号峰)、1，2-二亚油酸-3-软脂酸甘油酯 (3号峰)、1，3-二油酸-2-亚油酸甘油酯 (4号峰)、油酸亚油酸软脂酸甘油酯 (5号峰)、三油酸甘油酯 (6号峰)、软脂酸亚油酸硬脂酸甘油酯 (8号峰)和1，2-二油酸-3-硬脂酸甘油酯 (9号峰)。结果见表3。

3 讨论

3.1 提取方法的选择 根据制备工艺及样品的理化性质，选用石油醚 (60～90℃)为提取溶剂，采用索氏提取、回流提取、超声提取等提取方式分别提取样品进行考察，结果几种方法提取所得样品各成分基本无差别，为简便及降低成本和节约时间，采用超声法进行提取。

表3 HPLC-MS分析结果Tab.3 Result of HPLC-MS analysis

3.2 流动相的选择 本实验分别考察了三氯甲烷-乙腈、三氯甲烷-正己烷-乙腈、异丙醇-甲醇-乙腈、异丙醇-三氯甲烷-乙腈、正己烷-异丙醇-乙腈5个流动相系统，结果发现采用正己烷-异丙醇-乙腈流动相系统，各峰的分离度较好，且基线平稳，有利于指纹图谱的分析，因此最终采用正己烷-异丙醇-乙腈系统作为流动相系统。

3.3 色谱柱的选择 考察了相同色谱条件下采用Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm)、Agilent Eclipse XDB-Phenyl(4.6 mm ×250 mm，5 μm)、Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm)等色谱柱对鸦胆子油分离结果的影响。结果显示，使用 Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱，鸦胆子油中各成分分离度高，色谱峰尖锐，峰形较好，分离时间较短。

3.4 蒸发光检测器检测温度的选择 考察了相同色谱条件下蒸发光检测器检测温度为50℃、60℃、70℃时对鸦胆子油分离结果的影响。结果显示，50、60℃条件下基线噪音比较大，70℃效果较好。

3.5 指纹图谱评价 对采自海南、广州、佛山、深圳、厦门的10批鸦胆子油进行了指纹图谱分析，不同产地、批次鸦胆子油中主要成分的量略有差异，但指纹图谱中主要色谱峰的整体图貌基本一致，经相似度计算，10批样品指纹图谱相似度均在0.996以上，不同产地、批次的鸦胆子油指纹图谱无显著性差异。

［1］国家药典委员会．中华人民共和国药典:2010年版一部［M］．北京:中国医药科技出版社，2010:238．

［2］许植方，潘德济．中药鸦胆子化学成分的研究［J］．药学学报，1955，3(3):211-221．

［3］杨 峰，于 红，田玉峰，等．鸦胆子的研究概况［J］．黑龙江医药，1998，11(2):112-113.

［4］马玉坤，胡安新，邹 满．鸦胆子油的临床应用进展［J］．山东医药，2004，44(17):61-62．

［5］邢海燕，薛惠宁，蒋 可．鸦胆子油乳联合化疗治疗晚期非小细胞肺癌39例-附单纯化疗对照组30例［J］．辽宁中医杂志，2004，31(2):129-131．

［6］尹香菊，栾和芝，安春丽，等．鸦胆子油乳对宫颈癌Hela细胞的抑制作用及其作用机制［J］．中国肿瘤生物治疗杂志，2008，15(4):393-395．

［7］毕艳兰．鸦胆子的油脂品质分析［J］．郑州工程学院学报，2001，22(4):72-74．

［8］周春玲，陈晓辉，毕开顺．GC法测定鸦胆子中油酸与亚油酸的含量［J］．药物分析杂志，2006，26(7):996-997．

［9］周春玲，刘 艳．鸦胆子挥发油GC指纹图谱相似度分析［J］．西北药学杂志，2006，21(6):249-251．

［10］项 琪，周莉玲，姚崇舜，等．HPLC法测定鸦胆子油中脂肪酸［J］．中草药，2006，3(37):383-385．

［11］李 宏，岳昌林，项 琪，等．高效液相色谱法测定鸦胆子油乳注射液中脂肪酸含量［J］．中国现代应用药学杂志，2006，23(4)329-331．

［12］Rocha J M，Kalo P J，Ollilainen V，et al．Separation and identification of neutral cereal lipids by normal phase high-performance liquid chromatography，using evaporative light-scattering and electrospray mass spectrometry for detection［J］．J Chromatogr A，2010，1217(18):3013-3025．

［13］Tarvainen M，Suomela J P，Kuksis A，et al．Liquid chromatography-light scattering detector-mass spectrometric analysis of digested oxidized rapeseed oil［J］．Lipids，2010，45:1061-1079．

［14］Fauconnot L，Hau J，Aeschlimann JM，et al．Quantitative analysis of triacylglycerol regioisomers in fats and oils using reversedphase high-performance liquid chromatography and atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry［J］．Rapid Commun Mass Spectrom，2004，18(2):218-224．

［15］Holeapek M，Jandera P，Zderadieka p，et al．Characterization of triacylglycerol and diacylglcerol composition of plant oils using high-performance liquid chromatogrphy-atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry［J］．J Chromatogr A，2003，1010:195-215．

［16］Kemppinen A，Kalo P．Quantification of triacylglycerols in butterfat by gas chromatography-electron impact mass spectrometry using molar correction factors for［M-RCOO］+ions［J］．J Chromatogr A，2006，1134:260-283.