响应面法优化葡萄籽多酚提取工艺

唐华丽 熊汉国 王 玮

（1.重庆三峡学院生命科学与工程学院，重庆 万州 404000；2.华中农业大学食品科技学院，湖北 武汉 430070）

葡萄籽为落叶藤本植物葡萄的种子，是葡萄酒厂和果汁厂的主要副产品，因其富含多酚类物质、各种氨基酸等营养成分而具有重要的利用价值［1－3］。研究［4－6］表明，葡萄籽多酚作为葡萄籽提取物的主要成分具有很好的清除自由基、预防动脉粥样硬化、辅助抗肿瘤、美容等生理功能。国内外对葡萄籽多酚的提取工艺进行了广泛研究，但大部分研究存在工艺复杂［7，8］，耗时较长，得率较低［9］等不足。探索葡萄籽多酚类物质经济有效的提取工艺有利于提升葡萄籽废渣的附加值，具有极大的社会经济价值。本试验以葡萄籽为研究对象，采用有机溶剂法提取其中的多酚类物质，以多酚提取量为指标，采 用Design－Expert软 件 的Central Composite Design法设计响应面试验，优化葡萄籽多酚的提取工艺条件，以有效提高葡萄籽资源的利用率。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

葡萄籽：万州花鸟市场；

无水碳酸钠、硫酸亚铁、酒石酸钾钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、乙酸乙酯、正己烷、甲醇、乙醇、没食子酸、钨酸钠、钼酸钠、无水硫酸锂、溴水等：分析纯，重庆医药公司。

1.2 仪器与设备

紫外分光光度计：UV－2450，日本岛津公司；

分析天平：ML203，北京赛多利斯公司；

恒温水浴锅：HH－4，常州普天仪器制造有限公司；

离心机：TD5A－WSI，济南福的机械有限公司；

小型组织粉碎机：JJ－2，万州江东机械厂；

旋转蒸发仪：RE－52A，上海亚荣生化仪器厂。

1.3 试验方法

1.3.1 葡萄籽多酚提取工艺

1.3.2 多酚含量的测定 采用酒石酸亚铁比色法［10，11］。以没食子酸为标准品，配制成一定浓度后测定绘制标准曲线，得标准曲线回归方程：y＝0.586x－0.001 5，R2＝0.996 3。依标准曲线方程求出提取液中多酚质量浓度（mg／mL）。

1.3.3 提取试剂的选择 取0.500g葡萄籽粉，分别用10倍体积（V／m）70%体积分数的甲醇、乙醇、乙酸乙酯和丙酮溶液按照1.3.1工艺流程浸提，比较4种有机溶剂对多酚的浸提效果。

1.3.4 提取工艺单因素试验

（1）在提取温度70 ℃、提取时间20min、提取次数3次的条件下，分别考查不同体积分数（10%，30%，50%，70%，90%）的提取溶剂对葡萄籽多酚提取量的影响；

（2）在提取溶剂体积分数70%、提取温度70 ℃、提取次数3 次的条件下，分别考查 不同提 取时间（5，10，20，30，40min）对葡萄籽多酚提取量的影响；

（3）在提取溶剂体积分数70%、提取时间20min、提取次数3次的条件下，分别考查不同提取温度（40，50，60，70，80 ℃）对葡萄籽多酚提取量的影响；

（4）在提取溶剂体积分数70%、提取温度70 ℃、提取时间20min的条件下，分别考查不同提取次数（1，2，3，4，5次）对葡萄籽多酚提取量的影响。

1.3.5 葡萄籽多酚提取响应面法优化分析 本试验采用Design－Expert 8.05b软件的中心组合试验设计原理设计响应面试验。

2 结果与分析

2.1 提取试剂的确定

由图1可知，4种有机溶剂中，以丙酮为提取试剂的浸提效果最好，提取多酚含量可达2.468mg／mL，乙酸乙酯次之，甲醇最差。故本试验选用丙酮作为葡萄籽多酚的提取试剂。

2.2 葡萄籽多酚提取响应面法优化分析

在单因素试验的基础上，确定了各因素合适的条件范围，根据Central Composite Design中心组合试验设计原理，设计四因素三水平的响应面分析试验。试验因素水平见表1，设计及结果见表2。

图1 提取溶剂类型对葡萄籽多酚提取量的影响Figure 1 Effects of extraction solvent type on grape seeds polyphenols yield

表1 试验因素与水平表Table 1 Factors and levels

表2 响应面试验设计及结果Table 2 Response surface design arrangement and experimental results

根据响应面分析法试验结果，对试验数据进行多元回归拟合分析，得到葡萄籽多酚提取量与各因素变量的二次方程模型：

表3给出了由响应面分析法对上述数学模型和正交试验结果进行的方差分析结果。由方差分析结果可以看出，该模型P值小于0.01，表明二次方程模型极显著。而失拟项P值大于0.10不显著，表明该模型对试验的拟合情况良好，误差较小，可以通过该模型预测试验结果。各因素对葡萄籽多酚提取量的影响由大到小依次为丙酮体积分数（A）、提取温度（C）、提取次数（D）、提取时间（B）。因素间交互作用的响应面图见图2、3。

表3 葡萄籽多酚提取量的方差分析结果Table 3 Results of regression analysis of grape seeds polyphenols yield

图2 丙酮体积分数与提取时间交互作用对葡萄籽多酚提取量的响应面图Figure 2 Response surface plots showing the effect of acetone concentration and extraction duration

图3 提取时间与提取温度交互作用对葡萄籽多酚提取量的响应面图Figure 3 Response surface plots showing the effect of extraction duration and extraction temperature

由图2和图3可知，丙酮体积分数与提取时间（A）、提取时间和提取温度（B）之间的交互作用对葡萄籽多酚提取量有显著影响。

根据响应面分析所建立的数学模型，以及软件分析得出响应值较大的提取条件（表4试验1～5），将其与响应面试验（表2）中提取量最高的试验条件（表4 试验6）进行验证实验，以寻找葡萄籽多酚提取的最佳工艺条件，结果见表4。

表4 验证实验结果Table 4 Results of verification experiments

由表4可知，当丙酮体积分数为72%、提取时间32min、提取温度65 ℃、提取次数4次时，葡萄籽多酚提取量达到最大值。

3 结论

（1）本试验采用溶剂法对葡萄籽中多酚类物质进行提取，对比了4种不同有机溶剂对葡萄籽多酚类物质的提取效果，结果表明丙酮提取葡萄籽多酚工艺简单、提取时间短、提取率较高。

（2）利用Design－Expert软件设计响应面试验，优化葡萄籽多酚提取工艺条件，并进行验证实验。试验表明葡萄籽多酚的最佳提取工艺条件为丙酮体积分数 72%，提取时间32 min，提取温度65 ℃，提取次数4次，在此条件下多酚提取量可达2.892mg／mL。

（3）进一步提高葡萄籽多酚的提取率还需从释放与纤维素、蛋白质结合的结合态多酚着手。

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