豚鼠心室肌细胞延迟整流钾电流快慢成分在生长发育过程中的变化

朱晓冉，东 蕾，许彦芳

(教育部神经血管生物重点实验室，河北省新药药理毒理重点实验室，河北医科大学药理学教研室，河北石家庄 050017)

心肌细胞膜上的离子通道是维持心脏正常电活动的物质基础，其结构和(或)功能的异常称心脏离子通道病(cardiac channelopathies)［1］，包括基因突变所致的遗传性离子通道病和后天获得性离子通道病，后者见于疾病引发的通道功能改变、药物抑制心肌通道等。通道功能紊乱常引发心律失常，严重者可致心源性猝死［1］。因此研究心脏离子通道正常生理功能调节和病理变化具有重要的意义。

参与心室动作电位复极化的钾电流主要包括瞬时外向钾电流(Ito)、延迟整流钾电流(IK)及内向整流钾电流(IK1)等［2］。Ito是小动物，如小鼠、大鼠心室肌细胞主要的复极电流，IK是包括人类在内的大动物心室复极化的主要电流，按照通道动力学的不同将其区分为快激活(IKr)和慢激活成分(IKs)。豚鼠心室动作电位及其离子通道与人类具有相似性［3］，是目前研究IKr和IKs的常用动物。研究表明，心肌多种钾电流从出生到成年的发育过程存在明显变化，然而关于豚鼠在幼年至成年的发育过程中心室肌细胞IKr和IKs两种成分的变化尚未见报道。因此本研究采用膜片钳技术，观察延迟整流钾电流IKr、IKs以及动作电位在豚鼠从新生、幼年到成年发育过程中的变化规律，为相关研究提供背景资料。

1 材料与方法

1.1动物及分组清洁级Hartley♂豚鼠，河北医科大学实验动物中心提供，新生豚鼠为出生后1～2 d，体质量50～80 g;幼年豚鼠出生后2周，体质量90～120 g;成年豚鼠约3个月，体质量250～350 g。

1.2心室细胞急性分离豚鼠心室细胞分离参照文献方法进行［4］。先腹腔注射肝素2 000 U·kg－1后，戊巴比妥钠(0.1 g·kg－1)腹腔注射麻醉。迅速取下心脏，经主动脉进行Langendorff逆行灌流。调整灌流速度使新生、幼年及成年心脏分别为2.5、4.5和7 ml·min－1。在37℃下用100%O2饱和的无钙台氏液灌流约5 min。台氏液组成(mmol·L－1):NaCl 140、KCl 5.4、MgCl21、Glucose 10、HEPES 10(用NaOH调pH值至7.4)，之后用含0.4 g·L－1Ⅱ型胶原酶(Gibco公司)的无钙台氏液循环灌流5～15 min，当心脏变得柔软、松弛时用无钙台氏液冲洗5 min以终止反应，取下心脏。取左心室游离壁中层细胞保存于KB液中。KB液组成(mmol·L－1):KOH 80、KCl 40、KH2PO425、MgSO43、L-glutamic acid 50、taurine 20、EGTA1、Glucose 10、HEPES 10(用KOH调pH值至7.2)。细胞分离后6～8 h内用于电生理记录。

1.3电生理记录

1.3.1电流的记录采用全细胞膜片钳技术室温(23℃ ～25℃)下记录不同年龄段豚鼠心肌细胞的延迟整流钾电流。细胞外液组成(mmol·L－1):NaCl 132、KCl 4、MgCl21.2、CaCl21.8、Glocose 5、HEPES 10(用NaOH调pH值至7.4)，电极内液组成(mmol·L-1):KCl 140、Mg-ATP 4、MgCl21、EGTA 5、HEPES 10(用KOH调pH值至7.2)。向外液中加入尼莫地平(Nim，1 μmol·L－1)，阻断 L-型Ca2+通道，保持膜电位在－40 mV，使Na+通道和T-型Ca2+通道失活。在电压钳模式下，首先从－40 mV开始以阶跃电压10 mV的方式去极化到+50 mV，维持3 000 ms，而后保持 －40 mV 2 000 ms引出尾电流(IK-tail)，随后给予 2 μmol·L－1E-4031，特异性阻断IKr，记录IKs。用IK-tail-IKs-tail计算IK的快激活成分(IKr)的大小。以钳制电压为－50 mV，超级化－10 mV得到的细胞电容电流积分值，计算出细胞电容，求得电流密度(pA/pF)。

1.3.2动作电位的记录采用打孔膜片钳技术记录各年龄段豚鼠心室肌细胞的动作电位。细胞外液组成(mmol·L－1):NaCl 138、KCl 4、MgCl21、CaCl22、NaH2PO40.33、glucose 10、HEPES 10(用 NaOH 调pH值至7.4)，电极内液组成(mmol·L－1):谷氨酸钾 120、KCl 25、MgCl21、CaCl21、HEPES 10(用NaOH调pH值至7.4)。先用电极尖部充以少量不含两性霉素的电极内液，再用含两性霉素(终浓度600 μg·L－1)的电极内液充灌电极，用微电极操纵器将电极推向细胞，负压吸引形成高阻封接，5～10 min后转到电流钳下，细胞予以波宽10 ms，1Hz的方波，100% ～120%阈电流诱导动作电位，静息膜电位达不到－70 mV的细胞弃去不用。测量动作电位参数，包括静息电位、动作电位幅值、复极化90%需要的时间(APD90)等。

上述电生理数据的采集均在美国Axon公司的Axonpatch 200B放大器上由pClamp 8.1软件通过Digidata 1322A数模转换器转换完成。玻璃微电极由Sutter公司的Model P-97型电极拉制器通过六步法拉制而成。电极抛光后，充灌电极内液，控制电阻在2～4 MΩ之间。实验在室温(20℃ ～25℃)下进行。

1.4试剂配制除特殊标注外，实验中所用试剂均为Sigma公司产品。Chromanol 293B溶于DMSO配制成 10 mmol·L－1的储备液，储存于 －20℃;E-4031溶于水配制成1 mmol·L－1的储备液，储存于－20℃;Nimodipine溶于DMSO配制成100 mmol·L－1的储备液，避光保存。

1.5数据处理采用Clampfit 9.0(美国 Axon公司)和Origin 7.5(美国Origin Lab公司)软件进行图像处理及数据分析。所有实验结果用±s表示，采用单因素方差分析(ANOVA)比较组间的显著性差异。

2 结果

2.1发育过程中心室肌细胞IK的变化如Fig 1所示，豚鼠在新生、幼年及成年3个阶段的发育过程中，延迟整流钾电流IK的电流密度呈明显递增式变化，幼年组在－20～+50 mV范围内高于新生组(P＜0.01);成年组在－0～+50 mV范围内高于幼年组(P＜0.01)。

Fig 1 Current-voltage relationship for the IKtail current in neonatal(squares)，young(circles)and adult(triangles)guinea pig ventricular myocytes(n=8/8)(myocytes/guinea-pigs)

2.2发育过程中心室肌细胞IKs的变化区分延迟整流钾电流两种成分可以通过区分通道动力学差别或通过使用通道特异性阻断剂的方法，近年的研究中多采用后者［4］。通过依次加入IKr、IKs特异阻断剂，理论上应该全部阻断IK才能证明用阻断剂区分两种电流成分的可靠性。为此，我们依次加入2 μmol·L－1E-4031 和30 μmol·L－1chromanol 293B，记录电流阻断情况。如Fig 2所示，IK在依次加入两种阻断剂后可被完全阻断，表明记录方法的可靠性。故加入IKr特异阻断剂E-4031后剩余的成分即为IKs。比较新生、幼年及成年3个阶段IKs的电流密度可见(Fig 3)，幼年动物在－30～+50 mV较新生动物明显增加(P＜0.05或＜0.01)，成年动物又较幼年明显增长(－10～+50 mV，P＜0.01)。

2.3发育过程中心室肌细胞IKr的变化与新生动物相比，幼年动物的IKr在去极化电压－10 mV～+50 mV范围内呈明显增加(P＜0.01)。而幼年与成年相比，IKr的电流密度未见明显改变(P＞0.05)。

2.4发育过程中心室肌细胞动作电位的变化在1 Hz的刺激频率下，新生、幼年及成年豚鼠心室肌细胞静息电位分别为(－80.1±1.5)、(－81.6±1.8)及(－78.9±1.3)mV(组间比较无明显差别，P＞0.05);动作电位幅值分别为(127.9±2.1)、(129.3±3.0)及(131.7±2.5)mV(组间比较无明显差别，P＞0.05);APD90分别为(159.7±9.8)、(188.4±14.3)及(203.8±12.8)ms，幼年组较新生组明显延长(P＜0.01)，而成年又较幼年明显延长(P＜0.01)(Fig 5)。可见，豚鼠在发育过程中心室肌细胞静息电位和动作电位幅值未见明显改变，而APD90随年龄的增长逐渐延长。

Fig 2 Original current recordings in ventricular myocytes from neonatal，young and adult guinea pigs

Fig 3 Current-voltage relationship for the IKstail current in neonatal(squares)，young(circles)and adult(triangles)guinea pig ventricular myocytes(n=8/8)(myocytes/guinea-pigs)

3 讨论

心室复极化的各种钾电流存在明显种属差异，由于啮齿类动物心肌细胞缺乏或具极少量的IKr和IKs，故豚鼠是目前研究延迟整流钾电流的常用动物，但不同年龄发育阶段延迟整流钾电流和动作电位的变化情况目前尚不明确。我们的实验结果表明，豚鼠心室肌细胞延迟整流钾电流从新生、幼年到成年呈逐渐增加趋势。先前Kato等［5］曾报道，豚鼠心室肌细胞IK从胚胎、新生至成年发育过程中呈增长趋势，这与我们的实验结果一致。区分IKr和IKs两种成份显示，尽管IKr和IKs均随动物生长发育电流密度呈逐渐增加趋势，但它们的变化方式不同，其中IKr在幼年阶段即发育至成年水平，而IKs则从新生、幼年直至成年持续发育。以往的研究表明［6－7］，Ito在小动物伴随动物出生后的发育过程明显增大。主要维持动物静息电位的IK1，在小鼠［6］，大鼠［7］和家兔［8］从胚胎期到成年的发育过程中电流密度也不断增大。新生1 d的小鼠心室肌可记录到IKr和IKs，3 d时IKs明显增大，发育至成年后几乎记录不到IKr和IKs［9］。另有报道，新生犬心室肌细胞缺乏IKs［10］。上述的结果表明，不同的复极K+电流从新生至成年存在明显不同的发育模式和种属差异。

Fig 4 Current-voltage relationship for the IKrtail current in neonatal(squares)，young(circles)and adult(triangles)guinea pig ventricular myocytes(n=8/8)(myocytes/guinea-pigs)

Fig 5 Action potential recordings from neonatal，young and adult guinea pig ventricular myocytes driven at a constant frequency of 1 Hz under current clamp mode

心肌细胞的动作电位时程和形态取决于各种去极化内向电流和复极化外向电流之间的精细平衡。为说明上述发育过程中钾电流变化对APD的影响，本实验采用打孔膜片钳记录方式记录了不同发育阶段豚鼠心室细胞的动作电位。打孔膜片可以尽可能保持细胞内容物，使记录更接近于生理状态。结果表明，从出生到成年豚鼠心室肌细胞动作电位幅值和静息膜电位并没有明显的改变，而动作电位时程(APD90)随动物的发育过程逐渐延长。这与先前Agata用玻璃微电极技术记录到的结果一致［11］。尽管在其他动物发育中IK1逐渐增长［6－8］，确有人发现新生和成年豚鼠心室细胞IK1的电流密度没有明显差别［5］，这与本实验观察到的静息电位无明显变化相一致。此外，在对清醒豚鼠心电图的研究中也发现，成年组动物的QT和RR间期较幼年组明显延长［12］。由于豚鼠心肌细胞缺乏Ito，因此影响豚鼠心室肌细胞复极化的钾电流主要是延迟整流钾电流。显然这种动作电位时程的延长是一种与外向钾电流平衡的内向电流逐渐增强所造成。确有报道，成年豚鼠心室肌细胞中L-型钙电流的电流密度明显高于幼年豚鼠［5］，提示豚鼠心室发育过程中APD的逐渐延长主要因L-型钙电流的增加所致。

目前，豚鼠心脏是研究IKr和IKs的常用动物，特别是近年在药物影响心脏复极潜在致心律失常风险评价中［13］，上述关于IKr、IKs以及动作电位随发育改变的实验结果将为研究豚鼠电生理提供重要背景资料。

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