盐酸关附甲素对大鼠血管舒缩功能的影响及其机制

陆家凤，可 燕，蒋嘉烨，栗 源，李晓军

(上海中医药大学教学实验中心，上海 201203)

关白附为毛茛科植物黄花乌头〔Aconitum coreanum(Levl.)Raip.〕的块根，《名医别录》有记载“关白附辛温发散，可通经脉”;既可作为温里药散寒止痛，又可祛风痰治疗中风［1］。中风的原因之一是脑血管收缩或痉挛导致血压升高、血管张力增加变脆，最终脑出血［2］，而温里药普遍有扩张心脑血管，增加血流量，改善微循环的功效［3］。关附甲素(guanfu base-A，GFA)是关白附中的主要活性单体化合物［4］，早在20世纪80年代就有学者就其对血压的影响做过药理研究，发现大鼠颈外静脉注射GFA 30 mg·kg－1后血压出现下降［5］。故本实验旨在通过观察GFA对大鼠离体胸主动脉血管张力的影响，探讨其是否有扩血管功效，并分析可能的机制。

1 材料

1.1试剂和仪器关附甲素，批号:100665-200901，中国药品生物制品检定所;苯肾上腺素(phenylephrine，PE)，批号:P6126-5G，Sigma 公司;乙酰胆碱(ACh)，批号:A7000-5G，Sigma公司;毛喉素(forskolin，FSK)，批号:F6886，Sigma 公司;左旋硝基精氨酸甲酯(L-NAME)，批号:53-86-1，Adamas Reagent;亚甲蓝(methylene blue)，批号:61-73-4，Adamas Reagent;吲哚美辛(indomethacin)，批号:51298-62-5，Adamas Reagent。Krebs-Henseleit(K-H)液(1 mmol·L－1:NaCl 118，KCl 4.7，KH2PO41.2，MgCl21.2，NaHCO325，CaCl22.5，Glucose 11，pH=7.4);无钙液(1 mmol·L－1:NaCl 118，KCl 4.7，KH2PO41.2，MgCl21.2，NaHCO325，Glucose 11，pH=7.4):Powerlab八通道多功能生理记录仪(AD Instruments公司)。

1.2动物SD大鼠，(250±20)g，♂，购于上海斯莱克实验动物有限公司。

2 方法

2.1血管环的制备迅速取出胸主动脉置于4℃、含95%O2和5%CO2混合气体预饱和的K-H液中，剥除周围结缔组织后制成3～4 mm的血管环。将血管环悬挂于4 ml K-H液的浴槽内，37℃恒温，并持续通入95%O2+5%CO2的混合气体。每个血管环给予2.0 g拉力，每15 min更换K-H液1次，平衡90 min。以60 mmol·L－1的KCl预收缩两次，以诱发最大收缩度，用K-H液洗脱拉力稳定后，加入1 μmol·L－1的 PE 收缩，待拉力达坪值后，加入10－5mol·L－1ACh，若血管舒张达 80% 以上，可认为内皮完整;制备去内皮血管环时，可用棉签轻拭血管环内表面，当加入10－5mol·L－1ACh后血管舒张度在20%以下为内皮被去除［6］。

2.2累积浓度的GFA对基础状态及KCl预收缩血管环的影响将内皮完整及去内皮的胸主动脉随机分为:①内皮完整GFA组(GFA Endo+);② 内皮完整对照组(Control Endo+);③ 去内皮GFA组(GFA Endo－);④ 去内皮对照组(Control Endo－)。以不同累积浓度的GFA作用于基础状态及KCl(60 mmol·L－1)预刺激收缩的血管环，实验组(n=6)采用累积加药法，每2 min加GFA 1次，使浴槽中的 GFA 终浓度分别达 10－8、10－7、10－6、10－5、10－4mol·L－1，观察 GFA 对两种状态下血管舒张度的影响，对照组(n=6)以蒸馏水代替GFA累积加入。

2.3累积浓度的GFA对PE预收缩的血管环的影响分组及加药方法同“2.2”。实验组(n=6)以不同累积浓度的GFA作用于PE(10－6mol·L－1)预收缩的血管环，观察GFA对血管环的作用，对照组(n=6)以蒸馏水代替GFA累积加入。

2.4GFA对无钙液预处理的去内皮血管环的作用实验组(n=6)将血管去内皮后在无钙液中稳定30 min，加 GFA(10－4mol·L－1)共育 15 min 后，再加PE(1 μmol·L－1)收缩血管，观察 GFA 的作用，对照组(n=6)以K-H液代替GFA孵育去内皮血管环。

2.5GFA对L-NAME、亚甲蓝和吲哚美辛预处理的PE收缩血管效应的影响实验组(n=6)分别用L-NAME、亚甲蓝和吲哚美辛(浓度均为0.1 mmol·L－1)孵育内皮完整的血管环20 min，以PE预收缩，观察累积浓度GFA的血管舒张作用;对照组(n=6)以蒸馏水替代GFA累积加入。

2.6统计学处理结果以±s表示，应用SPSS 11.0软件统计分析，两组间比较采用t检验。

3 结果

3.1累积浓度的GFA对基础状态及KCl预收缩血管环的影响见Fig 1。累积浓度的GFA(10－8～10－4mol·L－1)对基础状态和KCl预收缩的内皮完整及去内皮的离体动脉环均无明显影响(P＞0.05)。

3.2累积浓度的GFA对PE预收缩血管环的影响见 Fig 2。累积浓度的 GFA(10－8～ 10－4mol·L－1)对 PE(10－6mol·L－1)预收缩的内皮完整的胸主动脉有浓度依赖性舒张作用，最大舒张率可达33.05%;各浓度的GFA对去内皮的胸主动脉无舒张作用，与PE预收缩最大时的张力相比，差异无显著性(P＞0.05)。

Fig 1 Effect of GFA on vasomotor function of aortic rings in basis tension(A)and precontracted by KCl(B)

Fig 2 Effect of GFA on vasomotor function of aortic rings precontracted by PE

3.3L-NAME、亚甲蓝和吲哚美辛对GFA舒张血管作用的影响见Fig 3。与对照组相比，分别加入L-NAME、亚甲蓝和吲哚美辛处理后GFA对PE预收缩的血管产生舒张作用明显减弱。其中L-NAME组、吲哚美辛组与GFA组比较在10－7～10－4mol·L－1时差异有显著性(P＜ 0.01)，而在 10－8mol·L－1时与GFA比较差异无显著性(P＞0.05);亚甲蓝组则在 GFA 10－8～10－4mol·L－1时差异均有显著性(P＜0.01)。

Fig 3 Effect of GFA on vasomotor function of aortic rings after incubated with L-NAME，methylene blue or indomethacin

3.4 GFA对无钙液预处理的去内皮血管环的影响

见 Fig 4。GFA(10－4mol·L－1)及无钙液预处理后，血管对PE的收缩反应明显降低(P＜0.01)。

Fig 4 Effect of GFA on endothelium-denuded rings preincubated with Ca2+free medium

4 讨论

血管平滑肌和内皮细胞的形态及功能正常是形成健康血管的基础。非内皮依赖性途径下的血管平滑肌的舒缩主要与细胞外钙离子的内流和内钙离子的释放从而使细胞内钙离子浓度增加有关［7］。虽然KCl和PE均通过增加细胞内游离钙浓度而使血管收缩，但机制却不相同。KCl主要通过开放电压门控钙离子通道，使细胞外钙内流引起血管平滑肌细胞超极化，从而使血管收缩［8］。而PE通过作用于受体操作性钙通道(ROC)和通过激活磷脂酶C，后者产生甘油二酯(DG)和三磷酸肌醇(IP3)［9］，它们共同作用于钙通道使肌浆网内Ca2+释放［10］，而使血管平滑肌收缩。研究结果显示，GFA可以剂量依赖性地抑制PE诱导的内皮完整的血管收缩而对KCl诱导的内皮完整或去内皮的血管收缩均无效。为了进一步确定GFA舒血管的作用的机制是否与抑制内钙释放有关，又使用无钙液预处理去内皮的胸主动脉。发现血管环经过无钙液及GFA共育后，PE引起的收缩反应明显受到抑制，提示GFA对非内皮途径的血管舒张作用可能与抑制血管平滑肌细胞内质网钙释放有关，而与门控钙离子通道引起外钙内流无关。

另一种血管扩张途径为内皮依赖性舒张。在大血管中内皮细胞主要通过分泌血管舒张因子一氧化氮(nitric oxide，NO)和前列环素(prostacyclin，PGI2)而扩散到血管平滑肌细胞达到血管舒张作用［11］。为了进一步验证GFA引起血管舒张是否具有内皮依赖性。本实验分别选用内皮完整和去内皮组进行比较，发现GFA对PE诱导的内皮完整血管有明显的舒张作用(P＜0.01)，而去内皮的血管的舒张作用不明显(P＞0.05)，提示内皮系统途径可能参与了GFA的舒张血管作用。NO是由血管内皮中的一氧化氮合酶(eNOS)催化L-精氨酸而来，NO作为信号分子激活血管平滑肌细胞内的鸟苷酸环化酶(guanylate cyclase，GC)进而产生环磷鸟苷酸(cGMP)，使细胞内钙离子浓度降低，从而使血管舒张［12］。实验结果表明，选用非选择性NOS抑制剂L-NAME或鸟苷酸环化酶抑制剂亚甲蓝均可明显抑制GFA的舒张血管作用，说明扩血管机制可能是通过NO－GC－cGMP途径介导的，是内皮依赖性的。此外，血管内皮细胞还可在花生四烯酸限速酶环氧合酶(cyclooxygenase，COX)的作用下，把花生四烯酸转变为另一种内皮舒张因子前列环素(prostacyclin，PGI2)，它可作用于血管平滑肌产生环磷腺苷酸(cAMP)而使血管舒张［13－14］。实验证明，在使用非特异性环氧合酶抑制剂吲哚美辛孵育后，GFA的血管舒张功能明显降低，提示GFA的扩血管作用也可能由前列环素介导，环氧合酶途径亦参与了GFA扩血管作用。

心率的加快可增加血流对血管的剪切力，直接对内皮造成损伤;同时也能加速新陈代谢及心肌耗氧量、产生自由基，间接损伤血管内皮［15］。GFA是从中药关白附中提取分离的二帖类生物碱，其静脉注射液是我国独立研制的一类新药，可通过终止房颤、阵发性室上性心动过速，明显延长心房有效不应期而具有良好的抗心律失常作用［16－17］。虽然关白附是否可通过抗心律失常间接保护血管内皮有待进一步的论证;但本次研究证明了关白附可直接作用于血管，产生舒张作用。具体机制有非内皮依赖性舒张机制:抑制平滑肌细胞内质网钙释放，及部分内皮依赖性舒张机制:①参与NO－GC－cGMP途径，激活eNOS或鸟苷酸环化酶，增加NO生成量;②激活环氧合酶，增加PGI2含量。该发现对GFA在心血管系统药理作用的进一步开发及心血管疾病的合理临床用药指导有重要意义。

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