瑞芬太尼预处理对心力衰竭大鼠心肌的保护作用

王 斌，张 野，朱海娟，黄春霞，谢春林，吴运香，胡宪文，陈志武

(1.安徽医科大学第二附属医院麻醉科，安徽合肥 230601;2.安徽医科大学药理学教研室，安徽 合肥 230032)

慢性心力衰竭是各种心血管疾病发展的终末阶段，近年来呈上升趋势，严重威胁人类健康。合并慢性心力衰竭的心脏手术患者常会有心肌缺血/再灌注损伤，其防治措施有待完善。缺血预处理对于心力衰竭的心脏是否有保护作用尚不清楚，而且需中断器官供血，有驳于医学伦理学，临床实用性不强。瑞芬太尼(remifentanyl，REM)是临床麻醉中常用的阿片类药物。研究表明［1－3］，瑞芬太尼预处理可以减轻正常大鼠心肌缺血/再灌注损伤，而对慢性心力衰竭心脏缺血/再灌注是何影响尚未见报道。本实验旨在观察不同剂量瑞芬太尼预处理及缺血预处理对离体心衰大鼠心肌缺血/再灌注损伤的影响，并探讨其可能的机制。

1 材料与方法

1.1实验动物成年♂SD大鼠(安徽医科大学实验动物中心提供)，体质量(250±20)g，动物合格证号SCXK(皖)2005-001。

1.2药品试剂及仪器盐酸阿霉素(adriamycin，ADR)，批号:9QL0161(意大利 Prizer Italia S.r.l公司);盐酸瑞芬太尼，批号:1110206(宜昌人福药业有限责任公司公司);氯化三苯基四氮唑(TTC，美国Sigma公司);兔抗磷酸化Akt(Ser473);LDH试剂盒(南京建成生物工程研究所)。Langendorff离体心脏灌流装置(淮北正华生物仪器设备有限公司);powerlab测压系统(澳大利亚AD公司)。

1.3方法

1.3.1动物模型制备参照文献方法［4－6］，SD 大鼠尾静脉注射阿霉素，2 μg·g－1，共6周，累计 12 μg·g－1，制成阿霉素心衰模型。6周末大鼠腹腔注射质量分数为10%的水合氯醛3 μl·g－1、肝素1 U·g－1抗凝后开胸取出心脏，置Langendorff灌注架，逆行灌注，灌注压力为9.8 kPa，灌注液为K-H液(118.5 NaCl，4.7 KCl，1.2 MgSO4，1.2 KH2PO4，2.5 CaCl2，25.0 NaHCO3，11.0 Glucose，单位 mmol·L－1)。用体积分数为0.95的O2和0.05的CO2混合气平衡，pH 7.4，温度37℃，收集冠脉流出液。肺动脉圆锥处切开，以利于冠脉回流。于左心耳处剪一小口，通过该小口向左心室内置入充有蒸馏水的乳胶水囊导管，接压力换能器，连接Power Lab系统。改变水囊容积调节左心室舒张末压(LVEDP)为0.266～1.33 kPa。用3-0丝线在左冠状动脉前降支起始部缝一个线结，通过收集线结实现区域心肌缺血，缺血时表现为:心脏表面局部发绀、冠脉流量下降及LVDP减小。松开线结以完成心肌再灌注。全部操作完成后，心脏稳定15min，有明显心律失常的心脏弃之不用。

1.3.2分组随机将阿霉素心衰心脏分为6组:Sham组、CON 组、IPC组、RPC 1组、RPC 2组、RPC 3组。RPC 1、2、3组分别在缺血前给予浓度为10、30、60 μg·L－1的瑞芬太尼 5 min 后改用不含瑞芬太尼的K-H液5 min，共3个循环。除Sham组为持续灌注165 min外，所有心脏予以30 min缺血，90 min再灌注(Fig 1)。

1.3.3血流动力学记录基础值、再灌注5、30、90 min时心率(HR)、左室发展压(LVDP)、±dp/dtmax、冠脉流量(CF)。

1.3.4乳酸脱氢酶(LDH)分别收集基础值、再灌注5、30、90 min的冠脉流出液。用试剂盒酶法测定LDH的活性。

1.3.5心肌梗死面积实验结束后，将线结再次收紧，从主动脉内注入质量分数为0.25%EvenBlue。剔除非心室组织，将心肌置于－80℃冰箱中保存。将速冻后的心脏从心尖到心基部平行切5～6片，2 mm厚的心肌片，置质量分数为1%的TTC溶液中，在37℃(pH 7.4)温孵15 min染色后置质量分数为10%福尔马林固定，缺血危险区(AAR)为红色，梗死区(IS)为白色。采用Image J图像分析软件测定左心室(LV)、右心室(RV)、AAR、IS的面积，面积乘以0.2cm即为各自体积。计算(LV+RV)、AAR/(LV+RV)、IS/AAR比值，以IS/AAR反映心肌梗死面积。

Fig 1 Experiment protocol

1.3.6心肌p-Akt表达水平采用Western blot法检测。再灌注90 min后取左心室心肌组织，迅速液氮冷冻保存，标本取齐后，剪碎心肌，加组织裂解液，冰上匀浆，4℃ 10 000×g离心5 min，取上清，BCA法测蛋白，配平，按照每 4 μl蛋白样品加入 1 μl SDS-PAGE凝胶上电泳，电转膜至硝酸纤维素膜上。质量分数为5%的脱脂牛奶封闭1 h，加入一抗(p-Akt，1 ∶500稀释;总 Akt 1 ∶500稀释)，4 ℃水平摇床孵育过夜，TBST冲洗，加入二抗(辣根酶标记山羊抗兔IgG，1∶10 000稀释)，室温振荡孵育2 h，TBST冲洗，化学发光，凝胶成像系统拍摄。采用Image-pro plus 6.0版图像分析软件分析，以p-Akt与总Akt灰度值的比值反映目的蛋白的表达水平。

1.4统计学处理采用SPSS13.0软件进行分析。计量资料以±s表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用配对设计资料的t检验。

2 结果

2.1血流动力学各组血流动力学指标基础值差异无显著性。与Sham组相比，其余各组在再灌5、30、90 min时的 LVDP、±dp/dtmax、CF 降低(P＜0.05)。与 I/R 组相比，再灌5、30、90 min时，RPC 2组和RPC 3组的 LVDP、±dp/dtmax、CF较高(P＜0.05)，并呈剂量依赖性。而IPC组和RPC1组的各项指标较I/R组差异无显著性。

2.2LDH活性LDH各组LDH基础值差异无统计学意义(P＞0.05)。与Sham组相比，其余各组在再灌5、30、90 min的LDH活性升高(P＜0.05)。与I/R组相比，RPC 2和RPC 3组在再灌5、30、90 min时的LDH活性降低(P＜0.05)。而IPC和RPC 1组的LDH的活性较I/R组无差异(Fig 2)。

Fig 2 Effect of remfentanil interventions on LDH release in coronary effluent in isolated perfused rat heart subjected to 30 min regional ischemia followed by 90 min reperfusion(±s，n=10)

2.3心肌梗死面积各组(LV+RV)、ARR、AAR/(LV+RV)差异无统计学意义(P＞0.05)。与Sham组相比，其余各组梗死面积升高(P＜0.05)。与I/R组相比，RPC 2和RPC 3组的梗死面积较小(P＜0.05)。而IPC和RPC 1组的梗死面积较I/R组差异无显著性(Fig 3)。

2.4p-Akt的表达p-Akt各组总Akt表达水平无差异(P＞0.05)。与 Sham组相比，其余各组p-Akt蛋白表达水平升高(P＜0.05)。与I/R组相比，RPC 2和RPC 3组p-Akt蛋白表达水平升高(P＜0.05)，而IPC和RPC1组p-Akt蛋白表达水平较I/R组差异无显著性(Fig 4)。

3 讨论

瑞芬太尼作为新的阿片类受体激动剂，其药效强、起效迅速、副作用小、剂量容易控制、安全可靠。瑞芬太尼对μ阿片受体有强亲和力，也作用于δ、κ受体。新近的研究［1－3］结果表明瑞芬太尼预处理对正常大鼠心脏的缺血/再灌注损伤可产生一定的保护作用。

Fig 3 Effect of remfentanil interventions on infarct size，as a percentage of the area at risk(IS/AAR)in isolated perfused rat heart subjected to 30 min regional ischemia followed by 90 min reperfusion(±s，n=6)

Fig 4 Western blot analysis of phosphor-Akt and total Akt at the 90 min of reperfusion(±s，n=4)

Tab 1 Hemodynamic parameters of each group(±s，n=10)

Tab 1 Hemodynamic parameters of each group(±s，n=10)

*P＜0.05 vs sham group，#P＜0.05 vs I/R group

Variable Group Basline Reperfusion 5 min Repe rfusion 30 min Reperfusion 90 min HR/beat·min －1Sham 252±28 242±25 238±30 229±25 I/R 248±36 234±33 225±27 228±26 IPC 256±18 230±36 229±30 222±23 RPC 10 μg·L－1 236±30 229±23 229±22 226±23 RPC 30 μg·L－1 242±37 231±40 226±35 214±34 RPC 60 μg·L－1 241±23 232±32 229±21 227±21 LVDP/kPa Sham 12.7 ±2.0 12.0 ±1.8 11.8 ±1.3 11.8 ±1.5 I/R 13.1 ±1.3 7.2 ±1.0* 6.6 ±1.1* 5.8 ±0.6*IPC 12.8 ±1.6 6.4 ±1.5* 6.4 ±0.9* 5.4 ±1.0*RPC 10 μg·L －1 12.6 ±1.9 6.7 ±1.6* 6.2 ±1.5* 5.6 ±1.6*RPC 30 μg·L －1 12.5 ±1.7 8.7 ±1.0*# 8.3 ±1.3*# 7.7 ±1.1*#RPC 60 μg·L －1 12.3 ±1.9 10.1 ±1.5*# 9.7 ±1.8*# 9.2 ±1.1*#+dp/dtmax/kPa·s－1 Sham 376±69 365±66 356±59 350±59 I/R 375±58 174±36* 156±45* 147±24*IPC 368±27 164±28* 157±25* 135±35*RPC 10 μg·L－1 344±36 172 ±44* 168±41* 157 ±51*RPC 30 μg·L－1 376±59 221±39*# 220±30*# 185±45*#RPC 60 μg·L－1 344±51 288±36*# 281±66*# 261±59*#－dp/dtmax/kPa·s－1 Sham 244±46 192±57 190±23 185±27 I/R 238±52 98±17* 94±22* 83±12*IPC 222±25 87±19* 86±17* 75±19*RPC 10 μg·L－1 221±27 89±25* 82±27* 76±26*RPC 30 μg·L－1 226±35 129±19*# 124±32*# 102±16*#RPC 60 μg·L－1 219±38 162±37*# 155±44*# 136±15*#CF/ml·min －1 Sham 20.4 ±2.1 17.0 ±1.3 16.0 ±1.2 15.2 ±1.3 I/R 20.2 ±2.3 9.6 ±1.8* 8.9 ±2.2* 8.0 ±1.8*IPC 19.6 ±3.2 10.8 ±1.6* 9.5 ±1.6* 9.0 ±1.5*RPC 10 μg·L －1 20.3 ±3.3 10.9 ±1.8* 9.4 ±2.1* 8.9 ±2.9*RPC 30 μg·L －1 22.1 ±3.6 13.7 ±2.5*# 12.8 ±2.4*# 11.7 ±2.4*#RPC 60 μg·L －1 19.2 ±2.7 15.1 ±1.7*# 14.7 ±1.8*# 12.9 ±1.6*#

1986年Murry首次描述缺血预处理即心肌在几次短暂的缺血后可以减轻随后较长时间的缺血后损伤［7］。而本实验研究发现，在阿霉素充血性心力衰竭大鼠缺血/再灌注模型中，缺血预处理的保护作用消失了。

近年来，研究［8－9］发现一些麻醉药物预处理(APC)能减轻心肌缺血/再灌注损伤。其机制是通过多种信号通路发挥心肌保护作用。其中，磷脂酰肌醇-3-激酶-丝氨酸/苏氨酸激酶(PI3K-Akt)通路在经过各种处理后予以激活，并发挥心肌保护作用［10］。PI3K-Akt介导的信号通路能够调节细胞的分裂、分化、凋亡等活动。大量研究证实［11－12］，Akt磷酸化的变化与心肌保护效应的变化有关。

本实验选用的是较成熟的Langendorff离体灌注模型，排除了神经、内分泌等多种因素的影响，从而观察药物对心脏的直接作用。HR、LVDP、±dp/dtmax、CF是离体灌注模型中反映心脏功能的有效指标。心肌梗死面积是反映心肌损伤的金标准。当急性心肌梗死时，冠状动脉血供急剧减少或中断，使相应的心肌严重而持久的急性缺血导致心肌坏死，促使大量的心肌酶如LDH等自坏死细胞释放，血液中相应的酶含量明显升高。在本实验中，单纯缺血/再灌注组心功能指标较Sham组明显下降，说明缺血/再灌注模型制造成功。

阿霉素是临床上常用的抗肿瘤药物，因其与心脏受体的高亲和力而使其心脏毒性明显［13－14］，单次或多次注射可致阿霉素心肌病，进一步发展为心力衰竭。

本实验发现，在阿霉素心衰大鼠离体心肌缺血/再灌注模型，适量的瑞芬太尼预处理可以减轻心肌的收缩和舒张功能障碍、减轻心肌梗死面积、降低LDH活性。用Western blot半定量分析p-Akt，显示瑞芬太尼预处理后使得p-Akt表达量增加，说明瑞芬太尼预处理与p-Akt的变化有一定的相关性。

综上所述，瑞芬太尼预处理可能通过增强Akt的磷酸化来减轻阿霉素心力衰竭大鼠的心肌缺血/再灌注损伤。

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