胞外信号调节激酶1/2通路在阿霉素引起的心肌细胞损伤中的作用

张莉莉，赖东平，王秀玉，郑东诞，郭润民，沈 宁，陈培熹，冯鉴强

(1.广东省医学科学院，广东省人民医院，广东省老年医学研究所综合科，广东广州 510080;2.江西省龙南县妇幼保健院内科，江西龙南 341700;3.中山大学中山医学院生理学教研室，广东广州 510080;4.中山大学附属第一医院黄埔院区心血管内科，广东广州 510080)

临床上，阿霉素(doxorubicin，DOX)是一种有效的抗癌药，常被用来治疗多种实体恶性肿瘤及白血病［1］，其抗癌作用似乎是剂量依赖的。但是，DOX能引起多种严重的副作用，例如，心肌病和充血性心力衰竭等［2－4］，故限制了其在临床上的应用。有研究指出，DOX引起的心肌毒性与氧化应激［4－6］及激活肿瘤抑制因子p53蛋白［7］等因素有关。

近年，细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2)在 DOX 引起的心肌损伤中的作用引起学者的重视。ERK1/2是丝裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族中的一个重要成员。在心肌细胞，多种生长因子及高渗刺激可激活ERK1/2，这种活化可能与心肌肥大或细胞保护有关［8－9］。然而，有关DOX对心肌ERK1/2的作用有3种不同的意见(激活、抑制或无作用)。Esaki等［8］认为，DOX 能抑制心肌细胞内ERK1/2的活化，肝细胞生长因子可通过激活ERK通路来保护心肌对抗DOX引起的心肌病。而Lou等［4］则认为，DOX能激活ERK1/2，抗氧化剂能抑制DOX引起的细胞凋亡及ERK1/2的活化。因此，深入探讨DOX对心肌细胞ERK1/2活化的影响及ERK1/2在DOX引起的心肌细胞损伤中的作用很有必要。

为此，本研究应用DOX处理来源于大鼠胚胎心脏的H9c2心肌细胞以建立细胞损伤模型，旨在探讨:(1)DOX对心肌细胞磷酸化(代表激活状态)ERK1/2表达的影响;(2)DOX对心肌细胞的损伤作用，包括对细胞存活率，氧自由基(reactive oxygen species，ROS)生成，线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential，MMP)及胱硫醚 γ-裂解酶(cystathionine-γ-lyase，CSE)表达等的影响;(3)应用ERK1/2抑制剂能否保护心肌细胞对抗DOX引起的损伤作用，以便为深入阐明DOX的心肌细胞损伤机制，特别是ERK1/2通路在其中的作用提供新颖的实验依据。

1 材料与方法

1.1材料DOX、ERK1/2抑制剂 PD-98059(PD)和双氯荧光素(2'，7'-dichlorfluorescein-diacetate，DCFH-DA)购自美国Sigma Aldrich公司。细胞计数试剂盒-8(cell counter kit-8，CCK-8)和罗丹明123(rhodamine123，Rh123)购自日本 Dojindo Lab。兔抗大鼠ERK1/2和CSE抗体购自美国Proteintech公司。DMEM-F12培养基和特级胎牛血清购自美国Gibco公司。H9c2心肌细胞由中山大学实验动物中心提供。

1.2细胞培养及处理H9c2心肌细胞在37℃、5%CO2条件下培养于含有12%特级胎牛血清的DMEM-F12培养基中。用DOX处理H9c2心肌细胞以建立DOX心肌毒性的体外模型。在DOX处理H9c2心肌细胞前用选择性ERK1/2的抑制剂PD-98059预处理以明确ERK1/2信号通路在DOX心肌毒性及CSE表达中的作用。

1.3细胞存活率的检测H9c2心肌细胞接种于96孔培养板中，每组4个复孔，约80%融合时，给予不同的处理因素。处理结束后，每孔加100 μl(1∶10稀释)CCK-8溶液，轻摇，37℃孵育3 h，用酶标仪(λ=450 nm)记录各孔的吸光度(optical density，OD)。取4孔OD值的平均数，按公式计算细胞存活率，细胞存活率/%=处理组OD/对照组OD×100%，重复5次。

1.4细胞内ROS含量的检测按照文献［10］介绍的方法检测胞内ROS的含量。当细胞生长到约80%融合时，根据实验需要给予不同的条件培养基。处理完成后，PBS洗 2次，细胞在 10 μmol·L－1DCFH-DA染液中37℃孵育10 min。在荧光显微镜下随机选取3个不重复区摄片，用ImageJ 1.41o软件的Color Histogram模块分析DCF的平均荧光强度(mean fluorescence intensity，MFI)，其大小反映ROS的含量。

1.5MMP检测按照文献［10］介绍的方法检测MMP。当细胞生长到约80%融合时，根据实验需要给予不同的条件培养基。处理结束后，用PBS洗2次，在含 100 μg·L－1Rh 123 的无血清培养基中37℃孵育30 min。在荧光显微镜下随机选取3个不重复区摄片，细胞核周围绿色的亮点即为摄取了Rh123的线粒体。用ImageJ 1.41o软件对绿色荧光强度进行半定量分析。

1.6Western blot法检测蛋白的表达H9c2心肌细胞接种于35 mm培养皿内，约80%融合时，给予不同的处理因素。处理完成后，用预冷的PBS洗2次，加入细胞裂解液，4℃静置30 min。12 000 r·min－1离心10 min，取上清，采用BCA法进行蛋白定量。总蛋白经SDS-PAGE分离后，转移至PVDF膜上。用5%脱脂奶粉封闭1.5 h。随后加入兔抗大鼠总(t)-ERK1/2抗体、磷酸化(p)-ERK1/2抗体或CSE抗体，室温孵育2 h，用TBST洗3次，加入相应的二抗，室温孵育1 h，漂洗3次。增强型化学发光(enhanced chemiluminescence，ECL)显色后，用 ImageJ 1.41o进行光密度分析，每样本重复3次。

1.7统计学处理实验数据用SPSS 13.0软件进行统计分析，计量资料以±s表示，组间比较采用One-way ANOVA及LSD-t检验。

2 结果

2.1DOX上调H9c2心肌细胞内p-ERK1/2的表达Fig 1结果显示，5 μmol·L－1DOX 处理 H9c2细胞1～6 h呈时间依赖性地增加p-ERK1/2的表达，其中处理3 h时p-ERK1/2的表达开始增加(P＜0.05)，处理6 h时，p-ERK1/2的表达约为正常对照组的2.4 倍(P＜0.01)。5 μmol·L－1DOX 对 t-ERK1/2表达水平无明显影响。

Fig 1 Effect of DOX on the activation of ERK1/2 in H9c2 cells(n=3)

2.2ERK1/2抑制剂抑制DOX引起的心肌细胞毒性如Fig 2所示，5 μmol·L－1DOX 处理 H9c2细胞24 h具有明显的心肌细胞毒性，使细胞存活率降低，与对照组比较，差异具有统计学意义(P＜0.01)。但是，在DOX处理H9c2细胞前30 min，应用10 μmol·L－1ERK 1/2 抑制剂 PD-98059 预处理能明显对抗DOX对细胞存活率的抑制作用(P＜0.05)。10 μmol·L－1PD-98059 本身对 H9c2 细胞存活率无明显影响。

Fig 2 Effect of ERK1/2 inhibitor on DOX-induced cytotoxicity in H9c2 cells(n=5)

2.3ERK 1/2抑制剂抑制DOX引起的胞内ROS生成增多Fig 3显示，正常对照组的H9c2细胞胞内 ROS水平较低，5 μmol·L－1DOX 处理 H9c2 细胞2 h可使胞内ROS水平明显升高，与对照组比较，差异具有统计学意义(P＜0.01)。10 μmol·L－1PD-98059本身对H9c2细胞胞内ROS水平无明显影响，但是PD-98059预处理30 min却能明显拮抗DOX对胞内ROS生成的促进作用(P＜0.05)。

2.4 ERK1/2抑制剂阻断DOX对MMP的抑制作用Fig 4结果显示，5 μmol·L－1DOX 处理 H9c2细胞24 h可明显降低MMP，与对照组比较，差异具有统计学意义(P＜0.01)。10 μmol·L－1ERK1/2抑制剂 PD-98059本身对心肌细胞的MMP无明显影响，但是 PD-98059预处理30 min能明显阻断DOX对MMP的损伤作用(P＜0.05)。

2.5ERK1/2抑制剂拮抗DOX对心肌细胞CSE表达的抑制作用如Fig 5所示，正常H9c2心肌细胞具有一定水平的 CSE表达。但是5 μmol·L－1DOX处理H9c2细胞24 h能明显抑制CSE表达，使CSE的表达水平约降低为原来的1/2，与对照组比较，差异具有统计学意义(P＜0.01)。10 μmol·L－1PD-98059本身对H9c2细胞内CSE基础表达水平无明显影响，然而PD-98059预处理30 min能明显地拮抗DOX对心肌细胞CSE表达的抑制作用(P＜0.05)。

Fig 3 Effect of ERK1/2 inhibitor on DOX-induced ROS generation in H9c2 cells(n=3)

3 讨论

目前，在基础研究方面，有关DOX对ERK通路的作用存在3种不同的结果:激活、抑制、无作用。在H9c2心肌细胞及新生大鼠原代培养的心肌细胞，Liu等［11］观察到，在DOX引起心肌细胞死亡前，先出现ERK1/2被激活;特异性ERK抑制剂PD-98059能阻断 DOX引起的心肌细胞凋亡。在小鼠实验模型，腹腔注射DOX能使心肌内的p-ERK表达明显减少［8］。然而，Spallarossa 等［12］在 H9c2 心肌细胞却没有观察到DOX对ERK磷酸化有明显的作用。

为了进一步明确ERK1/2在DOX引起的心肌损伤中的功能意义，本研究应用5 μmol·L－1(接近病人血浆中DOX的峰浓度)DOX处理H9c2心肌细胞1～6 h。Western blot检测的结果证实，DOX呈时间依赖性地上调磷酸化(代表激活)ERK1/2蛋白表达，这与Liu等［11］观察到的结果相似，但与其他的研究报道［8，12］不一致。另一方面，本研究观察到DOX对H9c2心肌细胞具有明显的损伤作用，表现为使心肌细胞存活率降低，ROS生成增多(反映氧化应激)，MMP丢失(反映线粒体功能受损)，上述的研究结果均与相关报道［4－6，11］相一致。此外，我们还观察到DOX能抑制CSE表达。CSE是心肌细胞内合成内源性硫化氢(H2S)的主要合成酶，H2S被认为是第3种内源性气体信号分子，具有心肌保护作用。由于DOX抑制了CSE表达，从而可能引起心肌细胞内源性H2S生成减少。有研究指出，应用H2S合成抑制剂抑制了内源性H2S生成能减弱缺血预处理对离体心脏及心肌细胞的保护作用［13］。因此，对CSE的抑制可能是DOX损伤心肌细胞的另一机制。Su等［14］也报道，在DOX处理大鼠后可使其血浆及心肌的H2S含量降低。重要的是，本研究证实ERK1/2抑制剂PD-98059能抑制阿霉素对CSE表达的抑制作用，提示ERK1/2通路参与阿霉素对CSE的损伤，这为深入阐明ERK1/2通路在阿霉素心肌毒性的作用提供了新颖的实验资料。

Fig 4 Effect of ERK1/2 inhibitor on MMP loss induced by DOX in H9c2 cells(n=3)

Fig 5 Effect of ERK1/2 inhibitor on the inhibition of CSE expression induced by DOX in H9c2 cells(n=3)

目前，对ERK1/2与细胞损伤的关系有不同的意见。有学者认为ERK1/2通路具有心肌保护作用［8］。但是，也有报道指出ERK1/2通路参与DOX对心肌细胞的损伤［11］。最近，Dong 等［15］报道，ERK1/2通路介导化学性低氧对心肌细胞的损伤作用。为了进一步探讨ERK1/2在DOX引起的心肌细胞损伤中的作用，本研究在DOX作用心肌细胞前30 min，应用选择性ERK1/2抑制剂PD-98059预处理H9c2心肌细胞。研究结果表明，ERK抑制剂可分别抑制DOX的心肌毒性，使细胞存活率升高;抑制胞内ROS生成增多;拮抗DOX对MMP的抑制作用，提示ERK1/2可能参与DOX对心肌细胞的损伤作用。Liu等［11］的报道支持本实验结果。但是，也有人认为，在DOX处理的小鼠，ERK1/2具有保护心肌作用［8］。有关ERK1/2在DOX引起的心肌损伤中作用不一致的原因可能是多方面的。可能与不同的实验模型，不同的作用剂量与作用时间，较重要的因素是可能与其他信号通路的活动状态有关［16］。因此，应用多种研究模型、研究技术与方法等进一步探讨ERK1/2通路在DOX引起的心肌损伤中的作用，将有助于阐明DOX的心肌损伤机制，也有利于寻找防治DOX心肌毒性的药物靶点。

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