大黄酚脂质体对阿尔采末病模型小鼠学习记忆的改善作用

朱成琳，张丹参，宋金艳，宋志斌，薛贵平

(河北北方学院药理学教研室，河北张家口 075000)

大黄酚(chrysophanol，Chry)为中药大黄的有效成分之一，近期研究表明，大黄酚具有明显的抗衰老作用［1］，并且还有抗大鼠肝、脑过氧化脂质生成的作用［2－3］。近期有研究者结合现代药剂新技术，制备出大黄酚纳米囊、微囊、包合物和脂质体等多种制剂，其中大黄酚脂质体的脂溶性较好，有脑部靶向性，对神经性损伤疗效最佳［4］。阿尔采末病(AD)是一种比较常见的神经系统退行性疾病，记忆减退和认知功能障碍是其主要的临床特征，大黄酚脂质体能否改善AD患者的学习记忆障碍，尚未见报道。本研究采用1次性直接侧脑室注射(icv)凝聚态β-淀粉样肽(Aβ25-35)的方法建立 AD 小鼠模型［5］，选择大黄酚脂质体制剂对AD模型小鼠学习记忆的影响进行观察并探讨可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1实验动物♂昆明种小鼠，体质量25～28 g，由中国医学科学院药物研究所提供(许可证编号:SCXK京2004-0001)。

1.2仪器LabTech UV9100全自动紫外可见分光光度计(LabTech公司);SIGMA 3K30高速冷冻离心机(德国);Forma－86℃超低温冰箱(Thermo elecerom);ME235P型电子分析天平(北京赛多利斯仪器有限公司);FSH-2型可调高速匀浆器(江苏大地自动化仪器厂);微量进样器(宁波市镇海玻璃仪器厂);STT-2跳台仪(中国医学科学院药物研究所);Y型水迷宫(中国医学科学院药物研究所);HH-1型数显恒温水浴锅(江苏金坛精达仪器厂);SZ-97自动三重纯水蒸馏器(上海亚荣生化仪器厂)。

1.3药品与试剂大黄酚标准品(中国生物制品检定所提供，批号110796-201017);大黄酚对照品(质量分数≥98%，陕西宝鸡国康生物药品有限公司，批号 GKSW20100814);β-淀粉样肽(β-amyloid peptide， Aβ25-35)(美 国 Sigma 公 司，批 号108K4794);N，N-二甲基甲酰胺、吐温-80、胆固醇、卵磷脂、邻苯三酚、钼酸铵、聚乙二醇2000、维生素E、无水乙醇等试剂均为分析纯;实验用水为三重蒸馏水。

1.4药品的制备制备大黄酚N，N-二甲基甲酰胺单体［大黄酚对照品用生理盐水:N，N-二甲基甲酰胺(DMF)∶吐温-80=8∶1∶1溶解］溶液［3］，薄膜蒸发法制备大黄酚脂质体［6］溶液，将这两种剂型均稀释成1 ×10－3mg·L－1备用。

1.5分组及给药取健康♂昆明种小鼠70只，体质量25 g～28 g，适应性饲养1周，按体质量均衡原则随机分为7组(n=10)，即正常对照组、Aβ25-35致AD模型组、大黄酚脂质体溶剂对照组、大黄酚单体组(10 mg·kg-1)、大黄酚脂质体高、中、低剂量组(10、1、0.1 mg·kg－1)［4］。

1.6建立Aβ25-35致AD模型方法Aβ25-35，用灭菌蒸馏水溶解，浓度1.0 mmol·L－1，密封后置37℃培养箱中孵育72 h，使其成凝聚状态，－20℃储存备用。将小鼠用3.5%水合氯醛(10 mg·kg－1)腹腔注射麻醉后，用手抓住小鼠头部皮肤并将皮肤拉紧，在距头部中线2 mm处与两侧耳根前部连线相交叉的点，用10 μl微量进样器垂直刺入3.0 mm，穿破颅骨，进入脑室，模型组、溶剂组、单体组、脂质体组缓慢注入Aβ25-35溶液3 μl，正常对照组缓慢注入3 μl生理盐水，并停留 5 min［5］。

1.7给药方法AD模型建立后，正常对照组和模型组立即尾静脉注射生理盐水，其余各组给予相应的溶剂和药物，10 mg·kg－1，每天1次，连续给药8 d。

1.8Y型水迷宫对实验动物学习记忆功能的测试d 3采用Y型水迷宫实验监测小鼠学习记忆功能。记录小鼠平均逃避潜伏期(从入水起点至寻找到阶梯出水的时间)和正确反应次数(以10 s内直接抵达平台为正确反应)［7］。预训练1 d，每天10次，每次训练时间定为3 min，3 min仍未找到安全通道者以180 s计算。正式测试2 d，每天10次，每次测试时间定为3 min，3 min仍未找到安全通道者以180 s计算。

1.9采用跳台实验对实验动物学习记忆功能的测试给药后6 d采用跳台实验训练小鼠学习记忆功能。跳台装置为一被动回避反射箱，箱底铺以铜栅作为刺激电极，箱内均分为5个小格，右后角放置一个的橡胶质平台作为回避电击安全区。实验时将5只小鼠分别放入反射箱的5个小格内适应3 min，然后通入36 V交流电，小鼠受电击，正常反应是跳回平台以躲避伤害性刺激。多数小鼠可能再次或多次跳至铜栅上，受到电击后又迅速跳回平台。以小鼠两前足同时接触铜栅遭到电击为错误反应，观察并记录5 min内错误反应次数［8］。24 h后测验，以观察其记忆保持情况，测试时记录小鼠在第1次跳下平台的潜伏期及5 min内的错误反应次数。以7 d和8 d的实验数据为正式测试数据。

1.10小鼠耐缺氧实验方法学习记忆实验结束后，将小鼠禁食12 h，自由饮水，用大剪刀于小鼠耳根后部快速断头，同时纪录小鼠张口次数和张口呼吸时间，测定小鼠断头耐缺氧生存时间，以5 s不再张口呼吸为观察指标不再计时［1］。

1.11比色法测定小鼠脑组织SOD、CAT酶活性学习记忆实验结束后，将小鼠禁食12 h，自由饮水，用大剪刀于小鼠耳根后部快速断头处死，迅速于冰盒上取其全脑(去小脑)，4℃生理盐水冲洗，滤纸吸干水分，精密称重，用4℃灭菌生理盐水制成10%脑匀浆，3 000 r·min离心15 min，取上清液，采用邻苯三酚自氧化法测定小鼠脑组织中SOD活性［9］，钼酸铵显色法测CAT活性［10］。

1.12数据处理数据资料采用Excel软件分析，用±s表示，并用SPSS17.0统计软件，运用t检验进行比较。

2 结果

2.1大黄酚脂质体对Aβ25-35致AD模型小鼠Y迷宫实验的影响结果表明:Aβ25-35模型组与空白对照组比较，模型组小鼠的逃避潜伏期明显延长(P＜0.01)，正确反应次数明显减少(P＜0.01);大黄酚脂质体高、中剂量组和单体组与溶剂对照组相比，潜伏期明显缩短(P＜0.05～P＜0.01)，正确反应次数明显增加(P＜0.05～P＜0.01)，大黄酚脂质体低剂量组对上述各项指标无改善作用(P＞0.05)，说明大黄酚脂质体的上述药理作用有剂量依赖性;大黄酚脂质体高剂量组与等浓度的大黄酚单体组也有明显差异(P＜0.05)。说明大黄酚脂质体上述药理作用要优于大黄酚单体溶液。见Tab 1。

2.2大黄酚脂质体对Aβ25-35致AD模型小鼠跳台实验的影响结果表明:Aβ25-35模型组与空白对照组比较，模型组小鼠的潜伏期明显缩短(P＜0.01)，错误反应次数明显增加(P＜0.01);大黄酚脂质体高、中剂量组、大黄酚单体组与溶剂对照组相比，潜伏期明显延长(P＜0.05～P＜0.01)，错误反应次数明显减少(P＜0.05～P＜0.01)，大黄酚脂质体低剂量组对上述各项指标无改善作用(P＞0.05)，说明大黄酚脂质体的上述药理作用有剂量依赖性;大黄酚脂质体高剂量组与等浓度的大黄酚单体组也有明显差异(P＜0.05～P＜0.01)，说明大黄酚脂质体上述药理作用要优于大黄酚单体溶液。见Tab 1。

2.3大黄酚脂质体对Aβ25-35致AD模型小鼠断头耐缺氧生存时间的影响结果表明:Aβ25-35模型组与空白对照组比较，模型组小鼠断头耐缺氧生存时间和张口呼吸次数均明显缩短(P＜0.01);大黄酚脂质体高、中剂量组、大黄酚单体组与溶剂对照组相比，小鼠断头耐缺氧生存时间和张口呼吸次数均明显增加(P＜0.05～P＜0.01)，大黄酚低剂量组对上述各项指标无改善作用(P＞0.05)，说明大黄酚脂质体的上述药理作用有剂量依赖性;大黄酚脂质体高剂量组与等浓度的大黄酚单体组也有明显差异(P＜0.05)，说明大黄酚脂质体上述药理作用要优于大黄酚单体溶液。见Tab 2。

Tab 1 Effects of chrysophanol liposomes on AD model mice in Y-maze and step-down test(±s，n=10)

Tab 1 Effects of chrysophanol liposomes on AD model mice in Y-maze and step-down test(±s，n=10)

△△P＜0.01 vs control;#P＜0.05，##P＜0.01 vs liposomes solvent;*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs chry

Group Dose/mg·kg－1 Y-maze test Step-down test Latent period/s No.of cor.Latent period/s No.of err.Control 4.30 ±1.76 6.7 ±2.3 210 ±43 0.7 ±0.5 Model 8.76 ±1.32△△ 3.4 ±1.7△△ 94 ±29△△ 2.9 ±0.9△△Liposomes solvent 8.21 ±1.54 4.1 ±1.1 101 ±26 2.5 ±1.1 Chry 10 5.27 ±2.12## 5.6 ±2.0## 143 ±51## 1.4 ±1.0##Chry liposomes 10 4.96 ±1.29##* 5.9 ±1.1##* 162 ±36##＊＊ 1.2 ±0.7##*Chry liposomes 1 6.69 ±1.44# 5.5 ±1.3# 121 ±22# 1.9 ±0.5#Chry liposomes 0.1 7.62 ±1.65 4.8 ±1.6 98 ±17 2.5 ±0.6

Tab 2 Effects of chrysophanol liposomes on AD mice SOD and CAT activities in brain and breakage anoxia tolerance test(±s，n=10)

Tab 2 Effects of chrysophanol liposomes on AD mice SOD and CAT activities in brain and breakage anoxia tolerance test(±s，n=10)

△P＜0.05，△△P＜0.01 vs control;#P＜0.05，##P＜0.01 vs liposomes solvent;*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs chry

Group Dose/mg·kg－1 No.mouth Survival time/s SOD/kU·g－1 CAT/kU·g －1 Control 11.2 ±3.1 14.39 ±4.10 693 ±12.6 14.8 ±3.6 Model 6.6 ±2.9△△ 7.78 ±3.12△△ 408 ±42.2△△ 7.3 ±3.2△△Liposomes solvent 7.4 ±1.9 9.89 ±2.38 416 ±26.7 8.7 ±2.0 Chry 10 9.5 ±3.2## 13.05 ±2.25## 551 ±44.9## 13.1 ±2.8##Chry liposomes 10 10.2 ±2.1##* 13.60 ±2.92##* 569 ±31.6##＊＊ 13.9 ±1.5##*Chry liposomes 1 8.9 ±2.7# 11.04 ±2.67# 470 ±27.6# 11.6 ±2.1#Chry liposomes 0.1 7.2 ±1.4 10.66 ±2.54 424 ±18.4 10.2 ±2.6

2.4大黄酚脂质体对Aβ25-35致AD模型小鼠脑组织中SOD与CAT酶活性的影响结果表明:Aβ25-35模型组与空白对照组比较，模型组小鼠脑组织中SOD与CAT酶活性均明显降低(P＜0.01);大黄酚脂质体高、中剂量组、大黄酚单体组与溶剂对照组相比，小鼠脑组织中SOD与CAT活性均明显升高(P＜0.05～P＜0.01)，大黄酚低剂量组对上述各项指标无明显改善作用(P＞0.05)，说明大黄酚脂质体的上述药理作用有剂量依赖性;大黄酚脂质体高剂量组与等浓度的大黄酚单体组差异有显著性(P＜0.05～P＜0.01)，说明大黄酚脂质体上述药理作用要优于大黄酚单体溶液。见Tab 2。

3 讨论

阿尔采末病是一种进行性中枢神经系统退行综合征，主要表现为记忆、认知、语言和行为障碍及人格改变等，其中以学习记忆下降为主要症状，严重影响中老年人的生活质量［11］，随着全球人口老龄化趋势日益明显，AD作为老年性痴呆中最常见的一种类型，已成为一个重要的社会问题，因此积极探讨痴呆性疾病的药物治疗和预防具有重大医学价值和社会意义。以往研究表明，大黄酚单体具有明显的抗神经性损伤作用，而本实验选择大黄酚脂质体制剂，采用尾静脉注射方式，发现脂质体制剂比单体溶液有更好的改善AD模型小鼠学习记忆的能力，并能提高脑组织中SOD与CAT的活性，提示大黄酚改善Aβ25-35致AD模型小鼠学习记忆能力的机制，可能是通过提高抗氧化酶活性，减少氧化应激介导的Aβ25-35的神经毒性，同时防止自由基组织对细胞的氧化损伤，保护神经细胞免受过氧化脂质的破坏，改善细胞功能和能量代谢障碍而实现的。本实验给药方式采用尾静脉注射方式，相比以往的腹腔注射、口服灌注等其他给药方式，能减少吸收过程带来的药物损失，而且静脉给药方式作用迅速，为大黄酚早日进入临床实验提供必要的实验支持。本实验还发现小剂量的大黄酚脂质体对改善小鼠学习记忆和酶活性的影响不明显(Chry 0.1 mg·kg－1，P＞0.05)，提示大黄酚脂质体的作用有剂量依赖性。

大黄酚脂质体具有明显的抗缺氧和提高小鼠耐力、抗疲劳的能力，可能与其扩血管作用有关［12］，本实验表明，AD模型小鼠断头耐缺氧生存时间缩短、张口次数减少，而大黄酚脂质体制剂能明显提高断头耐缺氧时间和张口次数，缺氧对机体是一种劣性刺激，尤其影响机体的供能。大黄酚脂质体在脑缺氧过程中也起到了保护作用，说明大黄酚制剂在Aβ损伤神经细胞的过程中起到了保护作用。

大黄酚难溶于水，口服吸收差且有肠胃刺激，将其制成脂质体制剂后，提高了药物的稳定性、安全性、有效性和靶向性［13］，对AD模型小鼠记忆功能障碍、老化相关酶和耐缺氧方面有明显的保护作用，因此，大黄酚脂质体制剂有可能成为治疗AD的新型药物。

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